专利名称：皮肌炎的诊断方法和诊断试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及诊断皮肌炎的方法和试剂盒，以及用于诊断皮肌炎的抗原蛋白的用途。
背景技术：
胶原病使其被视为自身免疫性疾病的基本特征是产生抗多种细胞组分的自身抗 体。已知对应这些自身抗体的许多抗原是生命过程中必不可少的酶和调节因子。预期研究 自身抗体及其对应抗原(自身抗原)的分子结构以及它们的生物学功能有助于阐明结缔组 织病的病理。多发性肌炎/皮肌炎(PM/DM)为炎性肌病，其中主要是骨骼肌炎症所引起的近端 肌无力和肌肉疼痛。特别是当观察到典型皮肤症状如向阳性皮疹和Gottron氏丘疹时，患 者被诊断为DM。多发性肌炎/皮肌炎是一种自身免疫性疾病，并且已知产生了多种自身抗 体。已经报道了在PM/DM患者血清中存在抗体；这些抗体包括在肌炎患者中特别检测到的 抗氨酰tRNA合成酶抗体(抗ARS抗体)、抗SRP抗体、抗Mi_2抗体和类似抗体以及抗UlRNP 抗体、抗SS-A抗体和与肌炎相关的类似自身抗体。已知的是，对于相同肌炎特异性自身抗 体为阳性的患者表现出相似的临床特征；这对于诊断、疾病类型分类、适当治疗方法的选择 和预后评估在临床上是有用的。相比之下，自身抗体阴性被认为是PM/DM亚型临床无肌病性DM(C-ADM)的特征之 一。C-ADM特异性自身抗体的存在是未知的。已知C-ADM抵抗临床治疗，并且与不良预后的 急进性间质性肺疾病(RP-ILD)有关。为了挽救患有RP-ILD的C-ADM患者的生命，已报道 和推荐联合利用高剂量类固醇疗法和免疫抑制药物给药的早期有效治疗的功效。因为这个 原因，具有相关RP-ILD的C-ADM的早期诊断在临床上是重要的，并且期望建立用于早期诊 断的新指标。根据以上背景，本发明人根据免疫沉淀(IPP)法研究了正常健康对照、患有包括 C-ADM在内的结缔组织病的患者以及患有特发性肺纤维化的患者的血清。本发明人发现 C-ADM患者的血清中存在能够识别一种140-kDa蛋白的新自身抗体，并且将该新自身抗体 命名为“抗CADM-140抗体”(非专利文献1 (NPL 1))。抗CADM-140抗体在患除C-ADM以外的结缔组织病患者、特发性肺纤维化患者和正 常健康对照中的任一组均未检测到。临床上观察到抗CADM-140抗体阳性患者中RP-ILD显 著地频繁发生，这表明抗CADM-140抗体与RP-ILD之间存在关联(非专利文件2)。该现象被认为对于预后特别不良的具有相关RP-ILD的C-ADM的早期诊断和治疗 选择是有用的，并因此希望改善其预后。MDA5 具有 SNP (http//www, ncbi. nlm. nih. gov/SNP/snp ref. cgi ？ IocusId = 64135)。其氨基酸序列和碱基序列的NCBI登录号为NM_022168。专利文献1 (PTL 1)公开 了 MDA5和癌症之间的关系。本发明人发表了非专利文献3 (NPL 3)，其公开了本发明所涉及的技术。
引文目录专利文献PTL 1 日本未经审查的专利文件2003-531581号非专利文献NPL 1 =Arthritis Rheum. 46(9) :S398，2003NPL 2 =Arthritis Rheum. 52(5) :1571-1576,2005NPL 3 =Arthritis Rheum. 60(7) :2193-2200,2009发明概述技术问题根据IPP方法，利用S35标记的白血病来源的K562细胞提取物或HeLa细胞对抗 CADM-140抗体进行了一般测量。虽然这是具有高灵敏度和高特异性的可靠测量方法，但是 该方法使用同位素并需要复杂的程序。因此，该测量方法仅在数量有限的实验室中使用。为了将抗CADM-140抗体的测量应用到实际临床诊断中，亟需建立能够容易地测 量大量样品的测量系统。鉴定与抗CADM-140抗体相应的抗原、制备重组蛋白及建立通过 ELISA的测量系统等对于建立该系统是重要的。问题的解决方案本发明人利用HeLa细胞cDNA文库克隆与抗CADM-140抗体相应的抗原基因，并且 研究了该相应抗原蛋白的分子序列。结果，本发明人发现MDA5(黑色素瘤分化相关基因5) 为与抗CADM-140抗体相应的抗原，并在这一发现的基础上完成本发明。本发明提供了用于皮肌炎诊断的试剂盒和方法，如下逐项所述。项1.用于诊断皮肌炎的试剂盒，其包含由抗CADM-140抗体识别的SEQ ID NO 4 所示的MDA5蛋白或其片段。项2.根据项1的用于诊断皮肌炎的试剂盒，其包含由抗CADM-140抗体识别的SEQ ID NO 2所示的MDA5蛋白C-末端片段或其片段。项3.根据项1的试剂盒，其中所述皮肌炎为与发生急进性间质性肺疾病的高风险 有关的临床无肌病性皮肌炎(C-ADM)。项4.根据项1的试剂盒，其用于通过酶联免疫吸附测定(ELISA)的测量。项5.根据项1的试剂盒，其包含(i)抗原，其包含MDA5蛋白或其免疫原性肽；(ii)介质，其适用于个体的样品与所述抗原⑴之间的反应；(iii)试剂，其用于检测所述抗原(i)与抗CADM-140抗体的复合物；以及任选的(iv)参照样品，其不含抗CADM-140抗体。项6.用于诊断皮肌炎的方法，其包括使个体的样品与由抗CADM-140抗体识别的 MDA5蛋白或其片段反应；以及当在所述样品中检测到抗CADM-140抗体时诊断该个体患有 皮肌炎。项7.根据项5的方法，其中所述样品为血液、血清或血浆样品。项8.根据项6的方法，其中所述样品中的抗CADM-140抗体通过ELISA来检测。项9.根据项6的方法，其包括以下步骤(i)将特定量的本发明的肽组合物沉积在微量滴定板的多个孔上；
(ii)将疑似患有皮肌炎的个体的样品稀释，并将稀释后的样品添加至所述孔；(iii)孵育后洗涤所述微量滴定板；(iv)将标记的抗人免疫球蛋白抗体引入所述微量滴定板的孔；并且(ν)通过与对照比较来检测与抗体结合的标记的量。项10.由抗CADM-140抗体识别的MDA5蛋白或其片段用于诊断皮肌炎的用途。发明的有益效果根据本发明可以高准确性地检测预后特别不良的临床无肌病性皮肌炎，其与发生 预后特别不良的急进性间质性肺疾病的高风险有关。本发明能够快速测量许多样品中的抗CADM-140抗体。这对于具有相关RP-ILD的 C-ADM的早期诊断和治疗选择是有益的，并且期望改善该疾病的预后，该疾病的治疗方法尚 未建立并且被认为是预后特别不良的疾病。此外，抗CADM-140抗体阳性样品的累积使得能 够分析外源性抗原，诸如为特异性自身抗体靶标的病毒，并且有助于阐明具有相关RP-ILD 的C-ADM的发病机理。附图简述
图1示出了根据免疫沉淀法研究作为抗原的克隆#8 (MDA5)蛋白与C-ADM患者血 清之间反应的结果，该研究在纯化克隆#8 (MDA5)蛋白并利用体外转录/翻译系统证实该蛋 白表达后进行。克隆#8(MDA5)与所有抗CADM-140抗体阳性血清样品反应，但它不与正常 健康对照血清反应。图2示出了根据免疫沉淀法研究作为抗原的克隆#8 (MDA5)重组蛋白与抗 CADM-140抗体阳性C-ADM患者、患有其他结缔组织病的患者以及正常健康对照的血清之间 反应的结果，该研究在纯化克隆#8 (MDA5)蛋白并利用体外转录/翻译系统证实该蛋白表达 后进行。该重组蛋白不与正常健康对照的血清或除抗CADM-140抗体阳性的C-ADM患者以 外患者的血清反应。图3示出了 IPP-IB的结果。当抗CADM-140抗体与表达MDA5的非洲绿猴肾细胞 来源的C0S7细胞提取物反应时，产生的140-kDa免疫沉淀物与山羊抗MDA5抗体反应。图4示出了抗CADM-140抗体阳性患者和正常健康对照的血清的免疫印迹结果，该 结果是通过利用重组RIG-I、重组MDA5和重组LGP-2作为抗原得到的。抗CADM-140抗体阳 性患者的血清仅与重组MDA5反应，而正常健康对照(NHC)的血清完全不反应。 图5示出了抗CADM-140抗体阳性的C-ADM患者、抗CADM-140抗体阴性的C-ADM 患者、PM/DM患者、硬皮病(SSc)患者、系统性红斑性狼疮(SLE)患者、ILD患者和正常健康 对照的血清ELISA结果，该结果是通过利用MDA5作为抗原底物得到的。截断值通过水平线 来显示。该ELISA系统的分析灵敏度和分析特异性分别为85%和100%。实施方案描述本发明的特征是由抗CADM-140抗体特异性识别的抗原(MDA5)，这被本发明人发 现。MDA5是RIG-I家族蛋白的一种类型。RIG-I家族蛋白参与包括生成I型干扰素的特异 性免疫应答。RIG-I家族蛋白高度同源并含有DexD/H盒解旋酶结构域。除MDA5之外，已 知RIG-I和LPG-2也为RIG-I家族蛋白。这些蛋白的序列和结构非常相似，并因此可能交 叉反应。因此还研究了抗CADM-140抗体与RIG-I家族蛋白之间的反应性。抗CADM-140抗 体与MDA5的结合依赖于抗原的构象，并且抗CADM-140抗体优先地与天然结构部分修饰的MDA5反应。这些因素使得难以确定抗CADM-140抗体是MDA5的抗体。为了鉴定抗CADM-140抗体，本发明人纯化了与其相应的抗原蛋白并试图通过质 谱分析法来鉴定抗原蛋白。然而，不可能纯化足量的抗原蛋白，并且鉴定是困难的。这被认 为是由于血清中抗原量少或由于抗原-抗体反应的亲和力。此外，在C-ADM早期，难以区分该疾病与其他类型皮肌炎，因为C-ADM难以诊断并 且需要继续小心地确定是否存在肌肉症状。然而，本发明人鉴定了抗CADM-140抗体特异性识别的MDA5。结果，很显然皮肌炎 (C-ADM)的ELISA测定的临床灵敏度和临床特异性分别为69%和99. 6%。虽然抗CADM-140 抗体阴性的C-ADM患者以前难以诊断或诊断通常花很多时间，但是本发明使其能够快速诊 断。在本说明书中，“皮肌炎”包括被称为DM以及DM的亚型-临床无肌病性皮肌炎 (C-ADM)，但不包括多发性肌炎PM。因此，本发明提供了用于诊断个体是否患有DM或C-ADM 或其他疾病的试剂盒和方法。DM为炎性肌病，其中主要为特征性皮肤症状如向阳性皮疹 和Gottron氏丘疹、以及由骨骼肌炎症引起的近端肌无力和/或肌肉疼痛。DM通常是根 据 Bohan & Peter 的诊断标准(Bohan A,Peter JB. Polymyositis and dermatomyositis. N Engl J Med 1975 ;292 :；344)来诊断的。然而，C-ADM 不满足 Bohan & Peter 的标准， 并且是不可诊断的，所述C-ADM指其中表现出DM的皮肤损害特征但未表现出肌无力的情 况。在2002年，Sontheimer提出新分类标准，其中将无肌无力的典型皮肤损害的情况称为 "C-ADM"(临床无肌病性皮肌炎)，并且将“C-ADM”归类为DM的亚型[Sontheimer RD =Would a new name hasten the acceptance of amyopathic dermatomyositis(dermatomyositis sine myositis)as a distinctive subset within the idiopathic inflammatory dermatomyopathies spectrum of clinical illness ？ J Am Acad Dermatol 2002 ； 46:6沈-36]。根据本发明诊断的靶标DM包括满足Bohan & Peter诊断标准的或满足 Sontheimer分类标准的那些。本发明的诊断试剂盒和诊断方法利用由抗CADM-140抗体识别的MDA5蛋白或其片 段来检测抗CADM-140抗体(以下“由抗CADM-140抗体识别的片段”有时简称为“免疫原性 肽”)。因为SEQ ID NO :4所示的MDA5蛋白的C-末端523氨基酸序列片段(SEQ ID NO 2) 与抗CADM-140抗体结合，所以抗CADM-140抗体识别的表位存在于MDA5蛋白的C-末端区 域。只要维持该表位，MDA5蛋白或其免疫原性肽可以为在其非表位区域中具有一个或多个 氨基酸缺失、替代、添加或插入的修饰的MDA5蛋白或其免疫原性肽。该表位通常由约5至 约10个氨基酸组成，并且特别是约5至约8个氨基酸。例如，MDA5的表位可以通过以下方 法来确定合成特定数量的肽(例如一次10个肽)，同时从SEQ ID NO 2所示的MDA5C-末 端片段的N-末端位移固定数量的氨基酸(例如5个氨基酸)(例如，制备由第一个至第十个 氨基酸组成的肽，由第六个至第十五个氨基酸组成的肽，由第十一至第二十个氨基酸组成 的肽，由第十六个至第二十五个氨基酸组成的肽，...)，然后研究各个肽片段与抗CADM-140 抗体的反应性。当表位确定或表位的位置缩小后，由抗CADM-140抗体识别的MDA5蛋白(免 疫原性肽)片段可以缩短。较短的免疫原性肽从易于生产的角度来看是优选的。由40个 或更少氨基酸、30个或更少氨基酸、或者20个或更少氨基酸、特别是约5至约10个氨基酸 组成的肽是优选的。RNA解旋酶是由MDA5编码的。
已知MDA5有SNP。本发明所使用的MDA5蛋白或免疫原性肽可以具有任何类型的 SNP。SEQ ID NO :3表示MDA5的碱基序列。SEQID NO :1表示编码SEQ ID NO :2所示的MDA5 片段的C-末端片段的碱基序列。然而，具有与SNP相关的其他氨基酸序列/碱基序列的 MDA5或MDA5的等位基因也包括在本说明书的“MDA5”范围内。可以将本发明的MDA5或免疫原性肽表达为重组蛋白，并通过基因工程来生产，或 者可以通过化学合成来生产。特别地，当免疫原性肽具有短序列，其由优选的50个或更少 氨基酸、更优选的30个或更少、甚至更优选的20个或更少以及尤其为5至10个氨基酸组 成时，优选地利用化学合成(固相或液相合成)生产该肽。MDA5或其免疫原性肽可以单体 形式使用，也可以通过诸如戊二醛的多官能团交联剂交联，或者能够通过利用其中免疫原 性肽串联连接的编码肽的DNA的基因工程来生产。抗CADM-140抗体可以从任何样品中获得，所述样品例如个体的血液、血清、血浆、 脑脊液和淋巴。血液、血清和血浆是优选的，并且作为样品的血清是特别优选的。本发明用于诊断皮肌炎的试剂盒包含MDA5蛋白或其免疫原性肽。该试剂盒可以 包含用于检测MDA5蛋白或其免疫原性肽与抗CADM-140抗体的抗原-抗体复合物的物质。 此类物质的实例包括用下述标记的抗人免疫球蛋白抗体，并且特别是用下述标记的抗人 IgG抗体诸如辣根过氧化物酶(HRP)的过氧化物酶，诸如β-半乳糖苷酶、碱性磷酸酶和 荧光素酶的酶标记，诸如FITC(异硫氰酸荧光素)和RITC(异硫氰酸四甲基罗丹明)的荧 光标记，或任何其他合适的标记。免疫测定优选地用于本发明的诊断试剂盒和诊断方法。免疫测定的实例包括酶免 疫测定(EIA)、ELISA、荧光免疫测定(FIA)、化学发光免疫测定、免疫印迹(IB)、蛋白印迹、 免疫染色以及类似方法。本发明使用的MDA5蛋白或免疫原性肽优选地结合于固相。此类固相的实例包括 琼脂糖、微量滴定板的孔、乳胶颗粒等。ELISA法的具体实例包括竞争性免疫测定、夹心免疫 测定等。根据本发明的诊断皮肌炎的方法，使获得自个体的样品与MDA5蛋白或其免疫原 性肽接触以通过物理或化学方法来检测MDA5或其免疫原性肽与抗CADM-140抗体的抗 原-抗体复合物存在或不存在。例如，本发明的诊断皮肌炎的方法包括以下步骤(i)将特定量的本发明的肽组合物沉积在微量滴定板的多个孔上；(ii)将疑似患有皮肌炎的个体的血液样品(血清或血浆)稀释，然后将稀释的样 品添加至所述孔；(iii)孵育后洗涤微量滴定板；(iv)将用酶标记、荧光标记等标记的人免疫球蛋白(例如IgG)添加至所述微量滴 定板的孔；然后(ν)与对照比较，检测与人免疫球蛋白结合的标记的量(在人免疫球蛋白用酶标 记标记的情况下，与酶作用的底物的量)。在优选的实施方案中，本发明的诊断试剂盒可以含有(i)抗原，其包含MDA5蛋白或其免疫原性肽(抗原可以附着在微量滴定板等的孔 中，并且还可以用封闭剂来封闭，所述封闭剂如脱脂乳，或者诸如牛血清白蛋白(BSA)或I的白蛋白)。(ii)介质，其适合用于个体样品与抗原(i)之间的反应(例如，诸如PBS的缓冲 液)；(iii)试剂，其用于检测抗原(i)与抗CADM-140抗体的复合物(例如，与抗 CADM-140抗体结合的标记的抗人免疫球蛋白抗体)；以及任选的(iv)参照样品，其不含抗CADM-140抗体。“不含抗CADM-140抗体的参照样品”包括例如正常健康对照的血液、血清和血浆样品。当抗人免疫球蛋白抗体用过氧化物酶标记时，抗CADM-140抗体可以通过以下方 法来检测，该方法包括加入诸如四甲基联苯胺的显色底物；用压304终止反应；以及用酶标 仪测量吸光度G50nm :0D450)。通过用本发明的诊断试剂盒测试大量样品并将获得的结果与其他临床观测结果 进行比较，能够建立基于测量的抗CADM-140抗体量的用于确定个体是否患有DM的更准确 的标准。
实施例下文对本发明进行了更详细地描述。
实施例1 C-ADM早期诊断方法通过使用表达利用HeLa细胞cDNA文库制备的λ ZAP噬菌体的大肠杆菌 (XLl-Blue MRF)来在大肠杆菌中表达抗原蛋白。将表达的蛋白转移至硝酸纤维素膜，并 与抗CADM-140抗体阳性血清反应以分离阳性克隆。然后，研究了获得的阳性克隆与抗 CADM-140抗体阳性C-ADM患者的10个血清样品、抗CADM-140抗体阴性个体的14个血清 样品O个C-ADM样品，2个PM样品，系统性红斑性狼疮、硬皮病和间质性肺疾病各1个样 品，以及7个正常健康对照样品)的反应性。在获得的9个克隆中，克隆#8以高频数与抗 CADM-140抗体阳性血清样品反应，即10个抗CADM-140抗体阳性C-ADM血清样品中的9个。 在蛋白纯化并且利用体外转录/翻译测定确认表达以后，通过免疫沉淀研究了 C-ADM患者 的血清与作为抗原的蛋白的反应性。克隆#8与所有抗CADM-140抗体阳性血清样品反应， 但不与正常健康对照的血清反应(图1)。此外，克隆#8不与结缔组织病患者的血清反应， 抗CADM-140抗体阳性C-ADM除外(图2)。此外，为了确定克隆#8的碱基序列，从获得克隆 的噬菌体DNA切下质粒DNA。将质粒DNA纯化以确定碱基序列。最后，对所得碱基序列进行 同源性检索，并且该序列与MDA5C-末端序列完全匹配。通过IPP-IB方法，将抗CADM-140抗体阳性血清与表达MDA5的非洲绿猴肾细胞 来源的C0S7细胞提取物反应。研究了 140kDa的获得的免疫沉淀物与山羊抗MDA5抗体的 反应性。当表达MDA5时，该免疫沉淀物与山羊抗MDA5抗体反应(图3)。此外，研究了抗 CADM-140抗体阳性血清及正常健康对照血清与作为抗原的RIG-I家族RIG_I、MD5和LGP-2 重组纯化蛋白之间的反应性。抗CADM-140抗体阳性患者的血清仅与重组MDA5反应，而正 常健康对照的血清不与重组MDA5反应(图4)。由以上结果清楚看到，与抗CADM-140抗体 相应的抗原为MDA5。此外，本发明人用纯化的重组MDA5作为抗原来包被96孔板以建立用于抗CADM-140抗体测定的ELISA。研究了抗CADM-140抗体测定方法的诊断灵敏度和诊断特异性。 更具体地，将重组MDA5以0. 05 μ g/孔的量固定在96孔ELISA板上，并且用3 % BSA封闭。将血清样品(各作250倍稀释)以100 μ 1每孔的量分配到板上，并使其在室温下 反应2小时。作为二抗，使用5000倍稀释的过氧化物酶偶联的山羊抗人IgG。加入四甲基 联苯胺(lmg/ml)作为显色底物，并且用H2SO4终止反应。用酶标仪G50nm OD45tl)测量吸光 度。利用该测定系统，测量了包含C-ADM的胶原疾病患者的血清样品、间质性肺疾病(ILD) 患者的血清样品和正常健康对照的血清样品。结果显示抗CADM-140抗体阳性PM/DM患者 血清的反应性高于抗CADM-140抗体阴性PM/DM患者、硬皮病(Sk)患者、系统性红斑性狼 疮(SLE)患者、ILD患者及正常健康对照的血清(图5)。当将正常健康对照的平均值+高 达标准偏差的10倍定义为正常截断范围时，该ELISA测定系统测量的分析灵敏度和分析特 异性分别为85%和100%。因此，这些结果清楚地表明该测定是具有优异的灵敏度和特异 性的抗CADM-140抗体检测方法。
权利要求
1.用于诊断皮肌炎的试剂盒，其包含由抗CADM-140抗体识别的SEQID NO :4所示的 MDA5蛋白或其片段。
2.如权利要求1所述的用于诊断皮肌炎的试剂盒，其包含由抗CADM-140抗体识别的 SEQ ID NO 2所示的MDA5蛋白C-末端片段或其片段。
3.如权利要求1所述的试剂盒，其中所述皮肌炎为与发生急进性间质性肺疾病的高风 险有关的临床无肌病性皮肌炎(C-ADM)。
4.如权利要求1所述的试剂盒，其用于通过酶联免疫吸附测定(ELISA)的测量。
5.如权利要求1所述的试剂盒，其包含(i)抗原，所述抗原包含MDA5蛋白或其免疫原性肽；( )介质，所述介质适用于个体的样品与所述抗原(i)之间的反应；(iii)试剂，所述试剂用于检测所述抗原(i)与抗CADM-140抗体的复合物；以及任选的(iv)参照样品，所述参照样品不含抗CADM-140抗体。
6.用于诊断皮肌炎的方法，其包括使个体的样品与由抗CADM-140抗体识别的MDA5蛋 白或其片段反应；以及当在所述样品中检测到抗CADM-140抗体时诊断所述个体患有皮肌 炎。
7.如权利要求5所述的方法，其中所述样品为血液、血清或血浆样品。
8.如权利要求6所述的方法，其中所述样品中的抗CADM-140抗体通过ELISA来检测。
9.如权利要求6所述的方法，包括以下步骤(i)将特定量的本发明的肽组合物沉积在微量滴定板的多个孔上；( )将疑似患有皮肌炎的个体的样品稀释，并将稀释的样品添加至所述孔；(iii)孵育后洗涤所述微量滴定板；(iv)将标记的抗人免疫球蛋白抗体引入所述微量滴定板的孔；并且 (ν)通过与对照比较来检测与所述抗体结合的标记的量。
10.由抗CADM-140抗体识别的MDA5蛋白或其片段用于诊断皮肌炎的用途。
全文摘要
本发明的目的是鉴定与抗CADM-140抗体相应的抗原，生产重组蛋白，并建立通过ELISA等的测定系统。本发明提供了诊断皮肌炎的试剂盒，该试剂盒包含由抗CADM-140抗体识别的SEQ ID NO4所示的MDA5蛋白或其片段。
文档编号G01N33/53GK102138072SQ200980134163
公开日2011年7月27日 申请日期2009年7月31日 优先权日2008年9月1日
发明者佐藤慎二, 桑名正隆, 藤田尚志 申请人:学校法人庆应义塾