诊断受试者中的肝癌的方法及诊断肝癌的试剂盒的制作方法
【专利说明】
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本发明要求于2012年9月21日递交的美国临时专利申请61/704, 425,名称为"诊 断受试者中的肝癌的方法及诊断肝癌的试剂盒（METHODS OF DIAGNOSING LIVER CANCER IN A SUBJECT AND A KIT FOR DIAGNOSING LIVER CANCER)"的优先权的权益，该专利申请的全 部公开通过整体引用并入本文中以用于所有目的。
技术领域
[0003] 本发明涉及诊断受试者中的肝癌的方法，以及评定具有肝硬化的受试者发展成肝 癌的风险的方法。本发明还涉及诊断肝癌的试剂盒。
【背景技术】
[0004] 肝细胞癌（HCC)是全球最常见的癌症之一并且是癌症死亡的第二位最常 见的原因，同时具有全球高于50万例的年发病率（Kamangar et al (2006). J Clin 0ncol，24,2137-50;Boyle Ρ· (2008) .Annals of Oncology, 19:605-606)。由于诊断晚， HCC患者的结局仍然很差。目前，血清α-胎蛋白（AFP)水平和超声波检查法通常用于 HCC的筛查和诊断。但是，这种途径的临床用途因为多种原因而受限。首先，AFP不是 在所有HCC患者中都是升高的，并且AFP可能因为慢性肝病而升高，从而产生令人不满 意的敏感度和特异性。在20ng/ml的截断值（cut-off value)处，不同研宄均报道了敏 感度的范围为41%~64%，并且特异性的范围为80%~91% (Daniele et al，（2004) Gastroenterology. 2004Nov ; 127 (5Suppl I) :S108-12)。根据 2005 年出版的美国肝 病研宄学会（AASLD)的实践指南，推荐200ng/ml是诊断的截断点，同时敏感度为22% 且特异性高于 99 % (Trevisani et al, J Hepatol. (2001) Apr ;34 (4) : 570-5, Lok et al.，Gastroenterology (2010) Feb ; 138 (2) : 493-502)。在 2010 年，基于最近研宄的结果，用 于HCC监控的2010AASLD指南推荐超声单独用于监视，并且不再包括用于监视和诊断的AF ?出1'1111&51161'11^11，!1印3如1(^7(2011)]\&11';53(3):1020-22)。另一方面，超声具有它自己的 局限，难以在具有大块畸形物的肝硬化的肝脏中检测肿瘤。此外，超声的性能高度依赖于操 作者的经验和设备的精密性，并且生活在不发达地区中的人可能无法使用。由于这些原因， 已经投入了大量精力以寻找用于HCC筛查和诊断的更可靠的标记物。
[0005] HCC的理想的标记物应当是特异性且敏感的，并且来自容易获取的样本。随着高密 度微阵列和蛋白质组学的发展，近几年已经鉴定出了很多新的标记物。一种最初的探索途 径是寻找HCC肿瘤组织中的线索，诸如磷脂酰肌醇聚糖3(GPC3)和高尔基体蛋白73(GP73) (Liu et al.,World J Gastroenterol. (2010)Sep 21 ； 16 (35):4410-5,Capurro et al, Gastroenterology. (2003) Jul ; 125(1): 89-97)，并且通过 ELISA 或蛋白印迹（Western blot)验证它们存在于外周血中。一些研宄使用质谱绘制血浆中的蛋白图谱，以鉴定出蛋 白标记物，诸如骨桥蛋白（〇PN)(Shang et al，H印atology.(2012)Feb;55(2):483-90)。 其它研宄利用微阵列绘制来自血浆或血清的核酸的图谱，以鉴定出基因标记物或微 RNA(microRNA)标记物（Zhou et al，J Clin 0ncol.2011Dec 20;29(36):4781-8·)。在 HCC的新的标记物中，得到最广泛研宄的标记物是脱-γ-羧基凝血酶原（DCP)和糖型 AFP (AFP-L3)。尽管，报道称DCP的敏感度相对较好（74% )，但是它的特异性并不令人满意 (70% ~86%) (Marerro et al，Gastroenterology. (2009) Jul ;137(1):110_8, Lok et al， 上述）。得到的结论是，AFP和DCP都不是在检测早期HCC中补足超声的最佳方式（Lok et al,上述）。
[0006] 因此，需要找到适于HCC早期检测的新的标记物。
【发明内容】
[0007] 本发明提供了一种诊断受试者中的肝癌的方法。该方法包括确定获自受试者的样 品中至少一种标记物基因的基因表达水平，该至少一种标记物基因选自由肿瘤坏死因子α 诱导的蛋白3(TNFAIP3)的基因、双调蛋白（AREG)的基因和GTP酶IMP家族成员5(GIMAP5) 的基因组成的组。
[0008] 本发明还提供了一种评定具有肝硬化的受试者发展成肝癌的风险的方法。该方法 包括确定获自受试者的样品中至少一种标记物基因的基因表达水平，该至少一种标记物基 因选自由肿瘤坏死因子α诱导的蛋白3(TNFAIP3)的基因、双调蛋白（AREG)的基因和GTP 酶IMP家族成员5(GIMAP5)的基因组成的组。
[0009] 本发明进一步提供了一种诊断受试者中的肝癌的方法。该方法包括：确定获自受 试者的样品中的至少一种标记物蛋白的存在或量，该至少一种标记物蛋白选自由肿瘤坏死 因子α诱导的蛋白3 (TNFAIP3, SwissProt登记号：P21580)、双调蛋白（AREG，SwissProt登 记号：P15514)和GTP酶IMAP家族成员5(GIMAP5, SwissProt登记号：Q96F15)组成的组。
[0010] 本发明还提供了一种通过确定至少一种标记物基因的表达水平诊断肝癌的试剂 盒，该至少一种标记物基因选自由肿瘤坏死因子α诱导的蛋白3(TNFAIP3)的基因、双调蛋 白（AREG)的基因和GTP酶IMAP家族成员5 (GIMAP5)的基因组成的组。该试剂盒包括与所 述标记物基因的核酸分子的至少一种互补的一个或多个寡核苷酸。
【附图说明】
[0011] 当与非限制性的实施例和附图结合考虑时，参考详细描述将能更好地理解本发 明，其中：
[0012] 图1示出了在本发明中使用的研宄设计。在中山大学肿瘤防治中心（Sun Yat-Sen University Cancer Center)、广州第八人民医院（中国）征集的一组28位个体用于初始 发现的组中。这28位患者包括10位被诊断患有HCC的患者，12位被诊断患有慢性肝炎的 患者和6位健康患者。使用高密度基因微阵列绘制从HCC患者和慢性肝炎患者及健康个体 分离的白血球（WBC)中的基因表达图谱。在初始基因筛选之后，在中山大学肿瘤防治中心、 广州第八人民医院还征集了一组50位被诊断患有HCC的患者、50位被诊断患有慢性肝炎 的患者，这些患者用于建立练习群并且用于开发3-基因逻辑模型。这一模型在60位被诊 断患有HBV和HCC的患者及90位患有慢性肝炎的患者（CHB患者）的独立队列中得到了证 实，这些患者在新加坡中央医院和新加坡国立癌症中心及中山大学肿瘤防治中心征集。在 该研宄中总共包含256位个体（250位患有HCC或CHB的患者、6位健康个体）。除了健康 对照之外，所有患者对乙型肝炎病毒的表面抗原都是阳性的（HBsAg阳性）。
[0013] 图2示出了研宄参与者的临床特征，其中图2A在表1中示出了在广州中山大学肿 瘤防治中心征集的患者的临床特征，并且图2A在表2b中示出了在新加坡中央医院和新加 坡国立癌症中心征集的患者的临床特征。来自广州的75位患者被诊断患有HCC并且128 位是慢性肝炎患者，而来自新加坡的35位患者被诊断患有HCC并且12位是慢性肝炎患者。
[0014] 图3在表3(图3A)中示出了在本发明的练习组中鉴定出的9种显著性基因的差 异性表达和诊断特性（表3)。该练习组（练习群）包含50位被诊断患有HCC的患者和50 位被诊断患有慢性肝炎的患者。图3B示出了标记物TNFAIP3(曲线（a))、双调蛋白（AREG) 基因（曲线（b))、NFKBlA(曲线（c))、NFKB1Z (曲线（d))和CD83(曲线（e))的曲线下面积 (ROC)。图3C示出了标记物GTP酶IMAP家族成员6 (GIMAP6)(曲线（a))、GTP酶IMAP家族 成员4 (GIMAP4)(曲线（b))、GTP酶IMP家族成员5 (GIMAP5)的基因（曲线⑷）和GTP酶 IMP家族成员8(GIMAP8)(曲线（e))的R0C。图3A和图3B中的曲线下面积（AUC)以95% 的置信区间示出。
[0015] 图4示出了在练习组（图4A)和测试组（图4B)中的不同标记物模型的ROC(接 受者工作特征）曲线分析。更详细地讲，示出了用于单独的肿瘤坏死因子α诱导的蛋白 3(TNFAIP3)的基因（曲线（a))的ROC曲线分析，或用于TNFAIP3与双调蛋白（AREG)的基因 和GTP酶IMAP家族成员5 (GIMAP5)的基因组合（曲线（b))的ROC曲线分析。图4中的曲 线下面积（AUC)以95%的置信区间示出。通过逐步逻辑回归（正演法（forward method)) 开发模型。由优势比计算是HCC的概率，并且以0至1范围内的得分给出该是HCC的概率。
[0016] 图5示出了在不同的截止点（cutoff point)，来自练习组和测试组的用于单独的 TNFAIP3基因或用于TNFAIP3基因与AREG基因和GIMAP5基因组合的ROC分析的敏感度（真 阳性率（TPR))和特异性（1-假阳性率（FPR))在55%至92%之间。
[0017] 图6示出了在104位HCC患者和108位CHB患者中，对单独的TNFAIP3基因（曲 线（a))或TNFAIP3基因、AREG基因和GIMAP5基因的组合（曲线（b))，以及血清AFP(曲线 (C))的ROC曲线分析。
[0018] 图7示出了在14位已经被诊断患有巴塞罗那临床肝癌（BCLC)A期HCC的患者和 140位