诊断早期肝癌的miRNA组合及其试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明属于医学生物检测技术领域，更具体地，本发明设及诊断早期肝癌的miRNA组合及其试剂盒，W及其在无症状高风险个体的群体中鉴定早期肝癌中的应用。
【背景技术】
[0002]肝细胞性肝癌化CC)是世界范围内最常见的实体恶性肿瘤之一，占世界范围内癌 症相关死亡的第二位。由于缺乏有效的早期诊断或对肝癌潜在高危人群的临床前筛查方 法，因此利用现有的肝癌诊断方法确诊的病人仅有1/3适合手术切除。而运些患者的5年 生存率也非常不理想，整体不高于14% ;而肝癌早期患者的5年存活率则可提高近一倍，约 为27%。所W有力的、可信的，特别是针对无症状高风险人群的肝癌极早期诊断工具将有效 提高肝癌患者的生存率。
[0003] 目前使用得最广泛的肝癌筛检方法包括血清甲胎蛋白（AF巧检测和B超等影像学 检查等。AFP是目前全世界应用最广泛的肝癌肿瘤标志物，已经应用了数十年。然而，运种 单一的标志物灵敏度低，且经常出现假阳性结果，例如在大量的肝硬化患者中，AFP也会升 高。此外，血清AFP仅能检测出60%的肝癌患者。如此的敏感性、特异性目前均不令人满 意。而虽然改进的成像技术使人们有可能发现肝脏局灶性小病变，但是还很难区分良性病 变与肿瘤，并且检测通量低，需要昂贵的检测设备，不适合于多中屯、大样本的临床筛查。
[0004]因此，各国学者们从来没有停止过寻找新的更好的肝癌标志物的脚步。理想的肿 瘤标志物需要有较高的特异性，能够将肝癌与肝硬化、肝炎、肝脏再生结节等区别开来；同 时还需较高的敏感性，能够在肝癌早期提示诊断，且有易检测、可重复、侵入少的特点。
[0005]miRNAs是一种内源性的、长约22nt的RNA，它通过祀向mRNA导致其降解或翻译抑 制而在动、植物中起到重要的调节作用。miRNAs广泛存在于灵长类、晒齿类、鸟类、鱼类、蛹 类、蠕虫类、植物、病毒中，从2002年有统计的200多种到2008年底的将近9000种，miRNAs 的发现呈现爆发性增长，并且不断有新物种中的miRNAs被发现。人类miRNAs基因仅约占 基因总数的2%-3%，但却能调控人体内1/3的蛋白表达，运种转录后调控作用直接影响了 运些祀基因的功能，参与了包括消化系统在内的多个系统的生理、病理过程。miRNAs在消化 系统中的作用设及发育、老化、分泌、代谢、病毒感染、免疫反应、肿瘤等等方面。
[0006] 因此，鉴于miRNAs参与了人体内大量的调控，找到与肿瘤的发生发展有关的 miRNAs,可W为肿瘤的诊断或治疗提供新的有效途径。
【发明内容】
[0007]本发明的目的在于提供诊断早期肝癌的miRNA组合及其试剂盒。
[0008]在本发明的第一方面，提供一种用于检测肝癌的试剂盒，所述的试剂盒中包括：
[0009]特异性检测人hsa-miR-193a-3p的检测试剂；
[0010]特异性检测人hsa-miR-369-5p的检测试剂；
[0011]特异性检测人hsa-miR-672的检测试剂；
[001引特异性检测人hsa-miR-429的检测试剂；和
[0013] 特异性检测人let-7i*的检测试剂。
[0014] 在一个优选例中，所述的试剂盒中，所述的检测试剂是RNA逆转录引物、DNA扩增 引物和DNA探针。
[001引在另一优选例中，所述的试剂盒中，特异性检测人hsa-miR-193a-3p的检测试剂 是SEQIDN0:6所示的逆转录引物、SEQIDN0:7和SEQIDN0:8所示的扩增引物，SEQID NO:9所示的探针；
[0016] 特异性检测人hsa-miR-369-5p的检测试剂是SEQ ID NO: 10所示的逆转录引物、 沈Q ID NO: 11和沈Q ID NO: 12所示的扩增引物，SEQ ID NO: 13所示的探针；
[0017] 特异性检测人hsa-miR-672的检测试剂是SEQ ID NO: 14所示的逆转录引物、SEQ ID NO: 15和沈Q ID NO: 16所示的扩增引物，SEQ ID NO: 17所示的探针；
[001引特异性检测人hsa-miR-429的检测试剂是SEQ ID NO: 18所示的逆转录引物、SEQ ID NO: 19和沈Q ID N0:20所示的扩增引物，SEQ ID N0:21所示的探针；
[0019] 特异性检测人let-7i*的检测试剂是SEQIDNO:22所示的逆转录引物、SEQID NO: 23和SEQIDNO: 24所示的扩增引物，SEQIDNO: 25所示的探针。
[0020] 在另一优选例中，所述的试剂盒中还包括：
[0021] 特异性检测内参基因的检测试剂；较佳地，所述的特异性检测内参基因的检测试 剂是针对人USSnRNA的逆转录引物、扩增引物和探针；更佳地，所述的特异性检测内参基因 的检测试剂是SEQIDN0:26所示的逆转录引物、SEQIDN0:27和SEQIDN0:28所示的扩 增引物，SEQIDN0:29所示的探针。
[0022] 在另一优选例中，针对每一miRNA或内参的探针连接有特定的巧光基团。
[0023] 在另一优选例中，所述试剂盒中还可包括用于检测AFP的检测试剂。
[0024] 在另一优选例中，该试剂盒中还包括：阴性质控品和/或阳性质控品。
[00巧]在另一优选例中，该试剂盒中还包括：RNA提取试剂，逆转录反应试剂，PCR扩增试 剂和/或使用说明书。
[0026]在本发明的另一方面，提供hsa-miR-193a-3p、hsa-miR-369-5p、hsa-miR-672、 hsa-miR-429和let-7i*的用途，用于制备检测肝癌的试剂或试剂盒。
[0027] 在本发明的另一方面，提供特异性检测人hsa-miR-193a-3p、hsa-miR-369-5p、 hsa-miR-672、hsa-miR-429和let-7i*的检测试剂的用途，用于制备检测肝癌的试剂盒。
[0028] 在一个优选例中，所述的肝癌是早期肝癌，所述的早期肝癌包括极早期肝癌。
[0029] 在另一优选例中，所述的检测试剂是RNA逆转录引物、DNA扩增引物和DNA探针。
[0030] 本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见 的。
【附图说明】
[0031] 图1、用于鉴定肝癌诊断标志物miRNA组合的筛选、训练W及验证阶段的实验设计 流程图。
[0032] 图2、为确定本发明用于诊断肝细胞肝癌，特别是在无症状高风险患者中鉴定极早 期肝细胞肝癌的血液中标志物miRNA组合的主要方法步骤图。对照组包括健康、慢性乙肝、 非酒精性脂肪肝+酒精性脂肪肝、血管瘤受试者。
[0033] 图3、说明了包含本发明用于确定无症状高风险患者中鉴定极早期肝细胞肝癌的 血液中标志物miRNA组合（let_7i*、hsa-miR-193a_3p、hsa-miR-369_5p、hsa-miR-429、 hsa-miR-672)的逻辑回归模型。
[0034]A、训练集（n= 170)中极早期肝癌组与对照组比较时miRNA组合的诊断价值的 ROC曲线图。与AFP(Al)C= 0. 603)相比，miRNA组合在区分极早期肝癌组血清和对照组血 清时具有显著高的诊断准确度（AUC= 0. 764)。
[0035]B、验证集（n= 408)中极早期肝癌组与对照组比较时miRNA组合的诊断价值的 ROC曲线图。与AFP(Al)C= 0. 635)相比，miRNA组合在区分极早期肝癌组血清和对照组血 清时具有显著高的诊断准确度（AUC= 0. 798)。 图4、RNA逆转录过程中的条件。
【具体实施方式】
[0036] 本发明人经过深入的研究，首次掲示一种通过协同检测五种miRNAs的表达情况 来诊断肝癌，特别是早期肝癌的方法，本发明还提供了用于实施所述诊断的试剂或试剂盒。
[0037] 如本文所用待测样本"、"待测样品"、"分析物"或"待测核酸（如DNA，RNA)样品" 是指待检测的样本，其中含有一种核酸或多种核酸，需要了解其中是否存在目标核酸。本发 明中，所述的待测样本可W是：血浆，血清等。
[0038] 如本文所用，"目标核酸"是指感兴趣的核酸片段，除非另外说明，其是指人源的 hsa-miR-193a-3p、hsa-miR-369-5p、hsa-miR-672、hsa-miR-429和let-7i*。
[0039] 如本文所用，"探针"是指一种具有已知核巧酸序列的单链核酸，其具有与目标核 酸基本上互补的核巧酸序列结构，可W与"目标核酸"形成双链。所述的"探针"可W携带 标记物。例如，标记物可W连接在探针的5'末端或3'末端。
[0040]如本文所用，所述的"miRNA组合"是指由hsa-miR-193a-3p、hsa-miR-369-5p、 hsa-miR-672、hsa-miR-429和le