专利名称：：基于ZnO纳米棒阵列的肝癌早期诊断试剂盒的制作方法
技术领域：
：本发明涉及生物医学检测领域，特别涉及采用肿瘤特异性抗体改性ZnO纳米棒阵列薄膜检测肝癌的早期诊断和普查。
背景技术：
：肝癌是我国常见的恶性肿瘤之一，是我国位居第二的癌症"杀手"，常见于中年男性。因其恶性度高、病情进展快，病人早期一般没有什么不适，一旦出现症状就诊，往往己属中晚期。故治疗难度大、疗效差，一般发病后生存时间仅为6个月，人称"癌中之王"，在我国，每年至少有12万人被肝癌夺去生命，其中男性至少8万，已占全世界肝癌死亡总人数的45%，对我国人民群众的生命健康威胁很大。正是由于其临床发现时多已属中晚期，由此造成对肝癌极度恐惧的心理。为了有效地治疗肝癌，早发现、早诊断、早治疗(常称"三早")是关键，而早诊断是最重要的一环。最近美国国家癌症研究所提出一个"少发易治"的目标，希望2020年能使美国癌症的发病率下降25%，死亡率下降50%。"少发"在于做好一级预防工作即病因预防。"易治"则有赖于早期发现、早期诊断、早期治疗。肝癌的症状在早期很不明显，甚至患病后较长时间毫无不知感觉。待病情发展到一定程度才会逐步产生一些以肝区疼痛、食欲下降、疲乏无力、日渐消瘦等症状。到晚期限则会有黄疸、腹水、呕血、昏迷等表现。肝癌病人的上腹部常可摸到巨大的肿，但此时已到中晚期，甚至已向肺部等处转移。我国通用的肝癌临床分期标准是早期，指没有肝癌的症状和体征的病人。因为没有任何表现，所以又称为"亚临床期"。晚期，是指有黄疸、腹水或肝外转移的病例。介于早期与晚期之间的则称为中期。简单地说，早期肝癌没症状，有症状的已经不是早期肝癌。肝癌早期没有症状，病人不会主动到医院就诊，给早期诊断带来困难。虽然在病情发展后能产生症状，但常见的症状是肝痛、食欲下降等，与慢性肝炎、肝硬化类等类似。何况肝癌症又大多发生在慢性肝炎、肝硬化的基础上，所以很难依靠这些症状来诊断肝癌。即使摸到肿块或有黄疸、腹水，有时也难以与结肠癌、胰腺癌区别开来。所以诊断肝癌必须借助于各种特殊检査。因此医务人员希望能在肝癌早期无症状时得到发现，通过提高早期肝癌的检出率，才有可能实行早诊断、早治疗，提高长期生存率和降低死亡率。由于肝脏本身就是个血池，只要有0.1—0.2cm的癌块便可能在血液中发现AFP升高了，而此时用B超、CT、磁共振等的影像学检查还难以发现(通常癌肿块应在1.0cm左右才能被影像学确定诊断)。因此，有时比影像学检査阳性要早数月至l年左右，这能为病人赢得宝贵的、也许是决定命运的治疗时间。AFP具有早期诊断肝癌的价值，这是AFP优于其他癌性标志物难能可贵的特点。医务人员通过检测AFP，在人群中筛査或者在临床上诊断肝癌，并采取手术或相应治疗，已使众多的肝癌患者得以延长生命甚至最终战胜肝癌。.文献资料还证实原发性肝细胞癌中，70—90%的患者AFP呈阳性，通常AFP的血清浓度与肿块的大小和肿瘤细胞的分化程度有一定相关性。正常肝细胞不产生AFP，癌变的肝细胞则重新获得合成AFP的能力，且随着癌细胞的疯狂倍增，AFP的浓度可进行性增值。所以肝癌患者AFP随病程呈持续性、高浓度阳性，一般都在400^g/L以上。有学者提出AFP大于200wg/L、持续8周以上；或者大于4(X^g/L、持续4周以上，在排除了妊娠期及生殖器胚胎性肿瘤的可能性后，就可以做出原发性肝癌的临床诊断了。AFP是监测肝癌的良好指标，尤其对小肝癌的早期诊断获益非浅，但临床实践是错综复杂、千变万化的，单凭AFP的检测还存在一定的不足，还需检测与肝癌肿瘤相关的CEA、CA19-9以及CA125标志物的情况以期提高检测的准确率。由于具有快速高效、大批量、高灵敏度、专一性等特点，生物分子改性的ZnO纳米棒阵列薄膜已经开始被使用在蛋白质成分和功能等分析中。采用ZnO纳米棒阵列薄膜，可以与蛋白等生物分子牢固连接，具有激发波长宽、发光波谱窄、发光强度高等，这些特性使这种薄膜更具有广泛的实用意义，而可以用于生物信息检测及疾病诊断分析中。它已经成为继荧光素、酶标记纳米金颗粒、硅纳米线之后，较为先进而又很准确实用的一种非放射性检测标剂。它比目前常用的放射免疫分析、酶免疫分析、荧光分析和化学免疫分析等检测肿瘤方法相比要简单、快速，只需约十分钟即可完成，对操作人员要求不高，容易掌握。本发明的目的是提供一种用于原发性肝癌早期诊断普査的ZnO纳米棒阵列检测试剂盒，它能快速并且具有灵敏度高、特异性好、检测结果稳定等特点，从而能够从新鲜血样到输出结果迅速地完成肝癌标志物的检测方法和试剂盒。本发明的技术方案如下基于ZnO纳米棒阵列的原发性肝癌早期诊断试剂盒包括底板、微电场装置(附电泳槽、对电极)和缓冲液。其中底板下端包被有ZnO纳米棒阵列薄膜，而底板的上端包覆有吸水垫。在底板下端固定包被有抗AFP、抗CEA、抗CA19-9和抗CA125改性ZnO纳米棒阵列薄膜。其中阵列薄膜分为标记l、2、3、4的四个区域l区为AFP抗体改性的ZnO纳米棒阵列，2区为CA19-9抗体改性的ZnO纳米棒阵列，3区为CA125改性的ZnO纳米棒阵列，4区为CEA抗体改性的ZnO纳米棒阵列。本试剂盒还包括的微电场装置(附有电泳槽、电源)是提供快速富集样品中特异性抗原到ZnO纳米棒阵列表面的装置。其中电泳槽是2xlx2cm3的有机玻璃盛液槽，电源由微型光谱检测器提供。采用ZnO纳米棒阵列薄膜检测原发性肝癌的方法的步骤如下(1)将l一2ml测试者的新鲜血清加入到电泳槽中，并用缓冲液稀释到3—4ml;(2)小心插入检测底板到样品溶液中，液面与底板吸水纸下线齐平，然后安装好微电场，同时调节电极方向并接通电源，微电场电压为0.1—120V;(3)l—25分钟后关闭电源，小心取出用检测底板，然后用缓冲液横向冲洗底板的ZnO阵列检测区域以去除多余吸附的非肿瘤抗原蛋白，最后用热风吹干。(4)把检测底板装进光谱测试仪中，进行光谱检测。(5)将测定的底板发光强度与标准的光致发光强度进行比较，从而确定待测血样中与肝癌肿瘤有关的特异性目标抗原是否存在，以及数量。本发明的有益效果是，在经与肝癌肿瘤有关的特异性抗体改性ZnO纳米棒阵列薄膜表面通过微电场的作用下能够富集极稀溶液中的目标特异性抗原，并结合在ZnO纳米棒上而形成与肝癌肿瘤有关的特异性抗原一抗体结合的生物阵列，这种生物阵列能增强ZnO光致发光强度；根据电场富集后阵列的发光强度增加的百分数来得到肝癌的早期检测结论。图1:本发明的用ZnO纳米棒阵列通过微电场富集被检血清液中甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、糖类抗原(CA125)和糖类抗原(CA19-9)的示意图。图2:本发明的试剂盒底板的结构示意图。具体实施例方式下面结合实施例对本发明作详细阐述，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之内。实施例(1)将1.51111新鲜血清样品加入到电泳槽中，并用缓冲液稀释到3.5ml;(2)小心插入检测底板到样品溶液中，液面与底板吸水纸下线齐平；然后安装好微电场，调节电极方向，使检测底板连接电源正极，对电极为电场负极，并接通电源；(3)8分钟后关闭电源，小心取出检测底板，然后用缓冲液横向冲洗底板的ZnO阵列检测区域2—4次以去除多余吸附的非肿瘤抗原蛋白，最后用热风吹干；(4)把检测底板放入微型光谱测试仪中，进行光谱检测。其中激发光波长为270nm，检测到波长范围在290—380nm的发射光波；(5)将测定的底板发光强度与标准的光致发光强度进行比较，光波强度增加了35—75%，从而确定待测血清中与肝癌肿瘤相关的特异性抗原存在，计算其血清中各种标志物抗原含量见表l。表l实施例的检测结果(电泳时间8min、激发波长270nm)样<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>本发明与现有的荧光检测技术相比较，主要区别在于ZnO纳米棒阵列薄膜作为检测基底具有激发波长宽、发射波谱窄、发光强度高、无光漂白等特点，因而在检测中具有反应迅速和灵敏性好的特点。权利要求1.基于ZnO纳米棒阵列的肝癌早期诊断试剂盒，其特征在于它包括底板，在底板上端设置有吸水纸，在底板下端固定包被有抗甲胎蛋白(抗AFP)、抗癌胚蛋白(抗CEA)、抗糖类蛋白19-9(抗CA19-9)和抗糖类蛋白125(抗CA125)改性ZnO纳米棒阵列薄膜。其中阵列薄膜分为标记1、2、3、4的四个区域1区为AFP抗体改性的ZnO纳米棒阵列，2区为CA19-9抗体改性的ZnO纳米棒阵列，3区为CA125抗体改性的ZnO纳米棒阵列，4区为CEA抗体改性的ZnO纳米棒阵列。2.根据权利要求l所述的基于ZnO纳米棒阵列的肝癌早期诊断试剂盒，其特征在于，本试剂盒的组成还包括干燥剂、微电场装置(附有电泳槽、对电极)和缓冲液。3.根据权利要求2所述的基于ZnO纳米棒阵列的肝癌早期诊断试剂盒，其特征在于，本试剂盒所包括的微电场装置(附有电泳槽、对电极)是提供快速富集样品中特异性抗原到ZnO纳米棒阵列表面的装置。其中电泳槽是2xlx2cn^的有机玻璃盛液槽，微电场电压为0.1—120V，电源由微型光谱检测器提供。4.基于ZnO纳米棒阵列的肝癌早期诊断试剂盒，其特征在于，试剂盒的检测方法包括以下步骤(1)将l一2ml测试者的样品溶液加入到电泳槽中，并用缓冲液稀释到3—4ml;(2)小心插入检测底板到样品溶液中，液面与底板吸水纸下线齐平，然后安装好微电场，同时调节电极方向并接通电源；(3)l—20分钟后关闭电源，小心取出检测底板，然后用缓冲液横向冲洗底板的ZnO阵列1一4检测区域，从而去除多余吸附的非肿瘤抗原蛋白，最后用热风吹干。(4)把检测底板装进光谱测试仪中，进行光谱检测。5.根据权利要求2所述的基于ZnO纳米棒阵列的肝癌早期诊断试剂盒，其特征在于，本试剂盒所包括的缓冲液由下列成分组成Na2HP040.194g;KH2P040.0224g;二次蒸馏水100ml,调节pH值至7.3。6.根据权利要求l所述的基于ZnO纳米棒阵列的肝癌早期诊断试剂盒，其特征在于，抗AFP、抗CEA、抗CA19-9和抗CA125改性ZnO纳米棒阵列薄膜的制备是先采用溶胶—凝胶法在玻璃底板上生成ZnO纳米棒阵列薄膜，然后采用多肽縮合技术把上述抗体和蛋白通过化学共价键连接在ZnO纳米棒表面，形成生物分子改性的ZnO纳米棒阵列薄膜。7.根据权利要求4所述的基于ZnO纳米棒阵列的肝癌早期诊断试剂盒，其特征在于，检测方法还包括步骤(5)将测定的光谱信号与标准光谱信号进行比较，从而确定待测血清样中甲胎蛋白抗原、癌胚抗原、糖类抗原19-9和糖类抗原125是否存在、以及数量，并打印出检测结果。8.根据权利要求4所述的用于诊断早期原发性肝癌的ZnO纳米棒阵列检测试剂盒的检测方法，其特征在于，所述的可检测信号是ZnO纳米棒的光致发光信号。9.根据权利要求3、权力要求4所述的基于ZnO纳米棒阵列的肺癌早期诊断试剂盒，其特征在于所述的样品溶液为被检测者的新鲜血样、新鲜血液、新鲜血清。全文摘要本发明提供了一种用于肝癌早期诊断的ZnO纳米棒阵列检测试剂盒，该试剂盒使用了抗甲胎蛋白、抗癌胚蛋白、抗糖类蛋白19-9和抗糖类蛋白125，本发明试剂盒由包被有上述四种抗体蛋白改性ZnO纳米棒阵列薄膜和底板、微电场装置(附电泳槽、对电极)和缓冲液组成，本发明还涉及试剂盒的使用检测方法。本发明试剂盒可用于原发性肝癌肿瘤的良性、恶性的诊断和普查，特别是早期临床原发性肝癌的检测，也可用于肝癌术后化疗的监测及预后评估。本发明具有快速、灵敏、准确、可靠、易操作，适宜基层医疗单位及各级医院使用等特点。文档编号G01N33/543GK101358973SQ200710049658公开日2009年2月4日申请日期2007年8月2日优先权日2007年8月2日发明者姚亚东,尹光福,康云清,廖晓明,黄忠兵申请人:四川大学