基于afp抗原的afp纳米抗体a65的制作方法
【技术领域】
[0001 ] 本发明属于生物技术领域，具体涉及特异性结合甲胎蛋白（Alpha-Fetal Protein，AFP)的纳米抗体（单域重链抗体，Variable domain of heavy chain of heavychain antibody, VHH)及其应用。
【背景技术】
[0002] 甲胎蛋白是一种糖蛋白，由胎肝或成人肝脏产生，常见于在孕妇和婴儿的血液中， 但在健康成人血液中含量很少，目前主要用于原发性肝癌的早期诊断、疗效评估和预后评 价，是原发性肝癌（PHC)重要的血清学标志物。甲胎蛋白作为一种标志物在多种肿瘤中，尤 其肝细胞癌（HCC)中有着过度表现。随着对AFP基因结构及功能的进一步深入研究，其在 HCC的早期诊断及生物学治疗中越来越重要的作用。在其他肠胃管肿瘤如胰腺癌或肺癌及 肝硬化等患者也出现不同程度的升高。当肝细胞发生癌变时，会产生这种AFP，而且随着病 情恶化它在血清中的含量会急剧增加，甲胎蛋白就成了诊断原发性肝癌的一个特异性临床 指标。
[0003] 临床检测患者AFP的常规方法有放射性免疫法（RIA)，酶免疫法（EIA)和胶体金 法，目前化学发光免疫检测技术（CLIA)因其具有反应快、灵敏度高、准确度高，标记物稳 定、对人体无放射性或毒性危害且特异性强等特点，是目前为止公认最好的微量定量检测 方法。在检测研究性实验当中，需要大量的抗体应用于新型的、高效的检测方法的研究。纳 米抗体具备了特异的抗原结合能力及高亲和力，显示出了独特性质及在研究领域的巨大应 用潜能。且抗体以及抗原标准品非常昂贵，而且有些毒素具有危险性。
【发明内容】
[0004] 本发明利用噬菌体展示技术，从驼源免疫的单域重链抗体库中筛选能与靶分子 (AFP抗原）特异性结合的单域重链抗体（VHH)噬菌体克隆，以VHH作为AFP抗体应用于免 疫学分析检测领域。该方法筛选得到的VHH具有与AFP免疫反应特性，且特异性好、高亲 和力，可应用于AFP的免疫学检测。本发明以AFP标准品为靶分子，将靶分子固相包被于酶 标板上，投入驼源免疫的单域重链抗体库进行亲和淘选，获得了一种抗AFP纳米抗体，具有 SEQ ID N0. :1所示的氨基酸序列。其氨基酸序列的頂GT编号和结构域划分如图1所示。
[0005] 本发明所提及的AFP纳米抗体（VHH)包括四个框架区（Framework region, FR)和 三个互补决定区（Complementarity-determining region, CDR)。其中，框架区（FR1-FR4) 分别选自 SEQ ID N0. :2, SEQ ID N0. :4, SEQ ID N0. :6 和 SEQ ID N0. :8,互补决定区 (CDR1-CDR3)分别选自 SEQ ID NO. :3，SEQ ID NO. :5 和 SEQ ID NO. :7。框架区结构相对保 守，主要起着维持蛋白质结构的作用；互补决定区结构相对多样化，主要负责抗体的识别。
[0006] 本发明提供一种蛋白质或多肽，包含SEQ ID NO. :2，SEQ ID NO. :4，SEQ ID N0. :6 和SEQ ID NO. :8中的一个或两个及以上的氨基酸序列，且至少与其中一个的氨基酸序列有 90%同源性。
[0007] 本发明提供一种蛋白质或多肽，包含SEQ ID NO. :3, SEQ ID NO. :5和SEQ ID NO. :7中的一个或两个及以上的氨基酸序列，且至少与其中一个的氨基酸序列有80%同源 性。
[0008] 本发明还涉及编码AFP抗体氨基酸序列的核苷酸，其序列为SEQ ID N0. :9。
[0009] 本发明提及的基于AFP结合的纳米抗体可通过噬菌体扩增或基因工程重组表达 的方式进行大量制备。噬菌体扩增是指将展示有AFP纳米抗体（VHH)的噬菌体，通过生物扩 增的方式，大量繁殖生产展示有AFP的纳米抗体（VHH)的噬菌体粒子。基因工程重组表达 的方式是指将编码纳米抗体的基因，通过克隆至表达载体，以蛋白表达的形式进行AFP抗 体的大量制备。
[0010] 本发明还涉及所述AFP纳米抗体在非疾病诊断治疗目的免疫学检测分析中的应 用。免疫学检测的类型包括酶联免疫吸附检测、胶体金免疫层析、免疫斑点杂交等基于抗 原-抗体特异性反应的免疫学分析检测类型。
[0011] 本发明AFP纳米抗体在应用时，可以通过噬菌体扩增获得的展示有AFP纳米抗体 的噬菌体粒子直接用于分析检测以及将AFP纳米抗体经过原核生物或真核生物表达后以 蛋白的形式进行免疫学检测分析。
[0012] 本发明还涉及AFP纳米抗体在非疾病诊断治疗目的免疫学检测分析中的应用，具 体为AFP纳米抗体在制备吸附AFP的试剂中的应用。比如，可以将本发明AFP纳米抗体制 成免疫亲和柱，吸附抓取AFP，富集，以供进一步的研究等。
[0013] 本发明所述的氨基酸序列可以作为前体，通过随机或定点突变技术进行改造，能 够获得性质（亲和力、特异性和稳定性等）更好的突变体。
[0014] 本发明中所叙述的一些术语具有如下含义：
[0015] 同源性：描述两个或多个氨基酸序列的相似程度，第一个氨基酸序列和第二个氨 基酸序列之间的同源性百分比可以通过【第一氨基酸序列中与第二氨基酸序列中相应位置 处的氨基酸残基相同的氨基酸残基的数量】除以【第一个氨基酸序列中氨基酸总数】再乘以 【100%】来计算，其中第二氨基酸序列中的某个氨基酸的缺失、插入、替换或添加（与第一 氨基酸相比）被认为是有差别。另外，同源性百分比也可以利用已知的用于序列比对的计 算机运算程序（如：NCBI Blast)获得。
[0016] 结构域：蛋白质三级结构的基本结构单位，通常具有一定的功能。
[0017] IMGT编号：IMGT数据库（The International ImMunoGeneTics Database)中的一 种已经标准化的抗体氨基酸序列编号方法。具体编号方法可以参考文献（Ehrenmann，F.，Q. Kaas，et al. (2010). "IMGT/3Dstructure-DB and IMGT/DomainGapAlign:a database and a tool for immunoglobulins or antibodies,T cell receptors,MHC, IgSF and MhcSF. ^Nucleic Acids Res 38 (Database issue):D301-307. Lefranc, M. P. , C. Pommie, et al. (2003) ? 〃IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Ig superfamily V-like domains. ^Dev Comp Immunol 27(1) : 55-77.)中的描述。
[0018] 密码子（codon):亦称三联体密码（triplet code)，指对应于某种氨基酸的核苷 酸三联体。在转译过程中决定该种氨基酸插入生长中多肽链的位置。
[0019] 本发明的有益效果是：纳米抗体分子结构独特，分子量小，稳定易表达，且特异性 好，可以代替传统的单克隆抗体，避免了繁琐的制备过程，而且节约成本。本发明制备的AFP 抗体可以广泛用于AFP基础研究，医学诊断和检测，抗体药物开发等。本发明的纳米抗体方 法具有普遍适用性，可用于其他小分子物质模拟抗原的筛选和制备，具有很高的应用价值。
【附图说明】
[0020] 图1为AFP纳米抗体（VHH)的氨基酸编号及结构域示意图。
[0021] 图2为AFP双抗夹心ELISA标准曲线及CAE、NSE、CA-125交叉反应曲线。噬菌 体克隆检测AFP的最低检测限分别为0. 39ng/mL，线性关系分别为0. 9973,线性范围均为 l_200ng/mL〇
【具体实施方式】
[0022] 实施例1.驼源免疫单域重链抗体库的构建
[0023] 1)羊驼的免疫：
[0024] 选取一只健康成年羊驼，采取背部皮内、皮下多点注射的方式进行免疫，初次免 疫，弗式完全佐剂，免疫原剂量lmg ;第28天二次免疫，弗式不完全佐剂，免疫原剂量0. 5mg， 第49天三免，弗式不完全佐剂，免疫原剂量0. 25mg ;第70天四免，弗式不完全佐剂，免疫原 剂量0. 25mg。第三次加强免疫后第七天，采集羊驼外周血，用于构建噬菌体展示文库。
[0025] 2)驼源白细胞的分离：在离心管中加入淋巴细胞分离液，再加入血液样品，700g 离心20min ;小心吸取中间层悬浮的白细胞至一新的离心管中，加入1/2体积的PBS，800g 离心15min ;弃上清，用PBS洗下离心管壁上的白细胞，850g离心10min ;弃上清，300 yL PBS重悬白细胞并计数；以体积比1 :10加入裂解液（RNAiso)保存备用。
[0026] 3)总RNA提取：向上述裂解液中加入1/5体积的氯仿，剧烈震荡15s使其充分乳 化，室温静置5min ;4°C 12000g离心15min，取上清转移至另一新鲜离心管中；加入等体积 的异丙醇，充分混匀后室温静置l〇min ;4°C 12000g离心10min，弃上清，缓慢加入75%乙醇 lmL，小心洗涤离心管管壁；4°C，12000g离心5min后弃去乙醇；室温干燥沉淀5min，加入适 量的RNase-free水溶解沉淀，待RNA沉淀完全溶解后于-80°C保存。
[0027] 4)cDNA的合成：将反转录用的引物、dNTP Mixture和模板RNA混合，65°C 5min，迅 速冰浴。具体配制如下：
[0028]
[0029] 然后在上述Microtube中配置下列反转录反应液：
[0030]
[0031] PCR仪上按下列条件进行反转录反应：42°C 30min，50°C 30min，70°C lOmin。PCR产 物于-20°C保存备用。
[0032] 5)抗体可变区基因扩增：将反转录得到的cDNA作为模板进行PCR反应。
[0033] 第一轮 PCR :
[0034]
[0035] PCR 反应条件：94°C 4min ;98。(： 10s，55。(： 15s，72°C 45s，30cycles ;72°C 7min。
[0036] 采用试剂盒回收PCR扩增产物，适当稀释后作为第二轮PCR的模板。
[0037] 第二轮 PCR :
[0038]
[0039]
[0040] PCR 反应条件：94 °C 4min ;98 °C 10s，50 °C 15s，72 °C 45s，5cycles ;98 °C 10s， 68°C 40s，30cycles ;72°C 7min。
[0041] 6)文库构建：
[0042] A. VHH编码基因及载体的双酶切
[0043] 分别采用Sfi I和Not I酶对V