人源化抗hmgb1抗体或其抗原结合性片段的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及与HMGBl蛋白特异性结合、对HMGBl相关疾病的治疗、预防有效的人源 化抗HMGBl抗体及其抗原结合性片段。
【背景技术】
[0002] HMGBl(High Mobility Group Box 1，高迀移率族蛋白1)是作为与在尚未确立充 分的治疗法的脑梗塞、脑血管痉挛、脑外伤、动脉粥样硬化、外伤性脑损伤、败血症、神经源 性疼痛及各种关节炎等中迄今为止发现的肿瘤坏死因子和各种白介素等炎症性细胞因子 不同的早期炎症介质或迟发型炎症介质被重新发现并作为可能成为这些疾病的治疗法、预 防法的标靶而受到广泛关注的蛋白质（非专利文献1)。
[0003] HMGBl是在约40年前作为普遍存在于真核生物的细胞核内且与染色质结合的非 组蛋白蛋白质的一种、在电泳中显示出高迀移率的蛋白质被发现的。最初，作为属于高迀 移率族（HMG)蛋白质家族的一种被称为HMGl(High Mobility Group 1)，认为其对染色 质结构的维持、转录活性调节和DNA修复等发挥重要的功能。之后，作为膜结合性蛋白质 (amphoterin)被重新发现，进而作为与各种炎症性疾病相关的炎症介质被屡次发现，2001 年修订了高迀移率蛋白质家族的命名法，将HMGl更名为HMGBl。
[0004] HMGB1蛋白为由富含赖氨酸残基的215个氨基酸构成的25kDa的蛋白质，具有在哺 乳动物间非常高度保守的氨基酸序列。其结构由3个结构域构成，这3个结构域由被称为 A-box (或box-A)和B-box (或box-B)的2个DNA结合结构域、以及仅由天冬氨酸和谷氨酸 构成的羧基末端结构域（也称为C末端结构域或酸性尾部）构成。A-box和B-box分别由 高度保守的约80个氨基酸残基构成，带有强正电。B-box中存在TLR4 (toll-like receptor 4, Toll 样受体 4)结合结构域和 RAGE (receptor for advanced glycation end products， 晚期糖基化终产物受体）结合结构域。通过HMGBl与TLR4的结合，诱导炎症性细胞因子从 巨噬细胞/单核细胞的分泌。通过HMGBl与RAGE的结合，诱导内皮细胞和其他体细胞（包 括肿瘤细胞）的增殖、分化、游走、细胞表面蛋白质的表达。第三结构域、羧基末端具有由仅 含天冬氨酸和谷氨酸残基的30个氨基酸序列构成的结构，极端地带有负电。关于该C末端 部分的氨基酸序列，已知在哺乳动物间也仅存在2-3个位置的差异，是高度保守的。
[0005] 作为HMGBl蛋白的功能，最初认为有染色质结构的维持功能、转录活性调节功 能、DNA修复功能等，特别是在1999年由Tracey等人的研宄小组作为败血症中的迟发型 炎症介质被重新发现之后，陆续发现其在各种疾病的炎症性细胞因子级联反应中担负重 要的作用。已经阐明，HMGBl不仅局限于细胞的核内，而且伴随巨噬细胞、各种免疫系统细 胞的活化从核内向细胞质转移并向细胞外分泌（主动分泌）。或者，伴随由缺血、损伤引 起的细胞的坏死或凋亡，局限于核内的HMGBl被迅速释放（被动释放）。近年来，HMGBl、 热休克蛋白（HSP)等被认为是内源性损伤相关分子模式（damage-associated molecular patterns :DAMPs)之一，这些分子释放自由于非微生物性的原因（例如，缺血、外伤等）而 产生的损伤细胞。另一方面，来源于细菌的脂多糖（LPS)等被称为病原体相关分子模式 (pathogen-associated molecular patterns :PAMPs)，包括微生物来源的各种各样的产 物（product)。在细胞表面和细胞质内这两者中对后者进行识别、应答的受体被称为模式 识别受体（pattern recognition receptors :PRRs)，作为其代表性家族，有Toll样受体 (TLRs)。但是，TLR家族的一部分特别是TLR2、TLR4和TLR9识别、活化上述的DAMPs。特别 是已知HMGBl活化TLR4信号转导等，诱导炎症反应，产生例如TNFa的分泌亢进等。另外， 关于作为HMGBl的受体之一的RAGE，在使用RAGE敲除动物的研宄、使用抑制RAGE与HMGBl 的结合的肽或特异性抗体的研宄中显示，在由缺血引起的脑损伤（非专利文献2)和细菌感 染所伴随的败血症（非专利文献3)等疾病中，RAGE介导的炎症信息的传输对该HMGBl的 炎症反应的增强发挥重要的作用。即，这些释放到细胞外的HMGBl经由TLR4、RAGE等作为 强力的炎症介质起作用，进一步促进目前已知的炎症性免疫应答，由此导致各种严重疾病。
[0006] 这些HMGBl相关的疾病（HMGB1相关疾病；HMGBl-related disease)大致分为两 类。一类为败血症休克这样的可观察到来源于由微生物感染引起的免疫应答的HMGBl的细 胞外分泌的疾病组，另一类为脑梗塞这样的可观察到起因于由非微生物性原因引起的细胞 损伤的HMGBl的细胞外释放的疾病组。前者的情况下，例如，由感染产生的细菌来源成分 (细菌性脂多糖（LPS)等）诱导TLR4的活化。与此相应，由单核细胞、巨噬细胞等产生主动 的HMGBl的分泌，作为后期的炎症介质起作用。作为HMGBl相关疾病，可以列举败血症、关 节炎、动脉粥样硬化、各种感染症和各种免疫疾病等。后者属于如下情况：伴随着由缺血、外 伤引起的细胞坏死，在此之前存在于核中的HMGBl在数小时以内被迅速释放到细胞外（被 动释放），作为早期的炎症介质诱导各种炎症性细胞因子的产生，作为相关疾病，可以列举 脑梗塞、外伤性脑损伤、由器官移植时的缺血引起的疾病、心肌梗塞等。
[0007] 近年来，作为针对HMGBl相关疾病的治疗法或预防法，报道了关于使用HMGBl的抗 体的方法（专利文献1、2、4、5)、使用HMGBl蛋白的一部分片段作为拮抗剂的方法（专利文 献2和3)、使用抑制HMGBl的分泌的化合物的方法（非专利文献4)等的探索研宄等。特别 是作为在使用抗HMGBl的抗体的动物模型中的治疗法，报道了在败血症（专利文献1、4和 5)、急性肺损伤（非专利文献5)、由烧伤引起的结缔组织的损伤（专利文献2)、关节炎（专 利文献4、5和非专利文献6)、脑缺血（非专利文献7)、淀粉样变性（专利文献6)、门静脉 内胰岛移植时的肝损伤（非专利文献8)和神经源性疼痛（非专利文献9)等中应用的可能 性，但可以说这些研宄作为治疗药、预防药的研宄都只是刚刚开始。
[0008] 其中，我们揭示了大鼠来源的抗HMGBl单克隆抗体在脑梗塞（专利文献8、非专利 文献10和11)、脑血管痉挛（专利文献9)、动脉粥样硬化（专利文献10和非专利文献12)、 外伤性脑损伤（专利文献11和非专利文献13)和神经源性疼痛（非专利文献9)的动物模 型中是有效的。但是，大鼠来源的抗体存在免疫原性的问题，难以在人体中使用。
[0009] 现有技术文献
[0010] 专利文献
[0011] 专利文献 I :TO2000/047104
[0012] 专利文献 2 :W02002/074337
[0013] 专利文献 3 :W〇2〇04/046345
[0014] 专利文献 4 :W〇2〇〇 5/〇262〇9
[0015] 专利文献 5 :W02007/001422
[0016] 专利文献 6 :TO2008/075788
[0017] 专利文献 7 :W02012/136250
[0018] 专利文献 8 :W02007/049468
[0019] 专利文献 9 :W02007/135992
[0020] 专利文献 10 :W02011/037227
[0021] 专利文献 11 :TO2012/074043
[0022] 非专利文献
[0023] 非专利文献 I :Annu. Rev. Tmmunol. , 2011. (vol. 29)pl39
[0024] 非专利文献 2 : J. Neuros.，2〇〇8 (vol. 28) pl2〇23
[0025] 非专利文献 3 :Crit. Care, 2007(vol. ll)pR122
[0026] 非专利文献 4 :Biochem Pharmacol. 2012pl492
[0027] 非专利文献 5 J. Immunol.，2000 (165) p2950
[0028] 非专利文献 6 :Mol. Med.，2011 (vol. 17)pl039
[0029] 非专利文献 7 : J. Neurosci.，2〇〇6 (vol. 26) ρΜ13
[0030] 非专利文献 8 :Am. J. Transplant.，2〇10 (vol. 10) pi588
[0031] 非专利文献 9 :PLoS One. 2013(vol. 8)e73640
[0032] 非专利文献 10 :FASEB J.，2007(vol. 21)p3904
[0033] 非专利文献 11 !Stroke.，2011 (vol. 42)pl420
[0034] 非专利文献 12 :Arterioscle;r Thromb Vase Biol.，2011 (vol. 31) p313
[0035] 非专利文献 13 :Ann Neurol.，2012 (72) p373
【发明内容】
[0036] 发明所要解决的问题
[0037] 抗HMGBl抗体作为针对成为在尚未确立充分的治疗法的缺血/再灌注损伤、外伤 性脑损伤、神经源性疼痛和败血症等中观察到的致死性炎症反应的根源的炎症介质的拮抗 剂，潜在有可能成为解开这些疾病的治疗法、预防法上的问题的药剂的可能性，从而受到广 泛的关注。其中，我们揭示了大鼠来源的抗HMGBl单克隆抗体（#10-22)在脑梗塞（专利文 献8)、脑血管痉挛（专利文献9)、动脉粥样硬化（专利文献10)、外伤性脑损伤（专利文献 11)和神经源性疼痛（非专利文献9)的动物模型中是有效的。但是，大鼠来源的抗体难以 在临床中使用，为了将该大鼠抗体用于人，需要将抗体的大鼠部分尽可能地与人抗体进行 取代（人源化）以减弱抗体的免疫原性，并且需要维持或提高抗原特异性、亲和性、中和活 性。
[0038] 用于解决问题的方法
[0039] 其中，获取存在于产生大鼠抗体#10-22的杂交瘤中的该大鼠抗体基因，对大鼠抗 体#10-22的H链、L链、它们的可变区及它们的CDR的氨基酸序列进行分析，选出同源性高 的人来源的框架，反复进行了多次尝试，结果，成功地制作了抗原特异性、亲和性、体外中和 活性与大鼠抗体同等或更高的人源化抗体。
[0040] 已报道了多种人来源的抗HMBGl单克隆抗体作为现有技术，作为对HMBGl 与RAGE的结合的抑制活性最高且与HMGBl的C末端区域结合的人抗体，公开了 G4 (W02007/076200)。另外，作为最强力地抑制HMGBl与TLR4的结合介导的TNF α从巨噬细 胞/单核细胞的的分泌诱导的人抗体，公开了 S6(W02007/001422)。但是，确认了本发明的 人源化抗体在HMGBl与RAGE的结合抑制活性方面显著高于上述人抗体G4,在体外对HMGBl 的TLR4介导的TNFa分泌诱导的抑制活性方面也显著优于上述人抗体S6,此外，在败血症 模型小鼠中也具有高的致死防御效果，从而完成了本发明。
[0041] 即，本发明提供以下[1]~[16]所述的与HMGBl蛋白特异性结合的人源化抗 HMGBl抗体及其抗原结合性片段、含有该抗体或其抗原结合性片段的药物组合物等。
[0042] [1] 一种人源化抗体或其抗原结合性片段，其与存在于HMGBl蛋白的C末端结构域 的氨基酸序列（EEEDDDDE(序列号60))特异性结合，所述人源化抗体或其抗原结合性片段 中，
[0043] ⑴重链可变区（VH)含有：
[0044] (a)包含序列号7的氨基酸序列、或者在其氨基酸序列中具有1个~数个氨基酸残 基的缺失、取代、插入和/或添加的突变的氨基酸序列的重链CDRl的氨基酸序列、
[0045] (b)包含序列号8的氨基酸序列、或者在其氨基酸序列中具有1个~数个氨基酸残 基的缺失、取代、插入和/或添加的突变的氨基酸序列的重链CDR2的氨基酸序列、以及
[0046] (c)包含序列号9的氨基酸序列、或者在其氨基酸序列中具有1个~数个氨基酸残 基的缺失、取代、插入和/或添加的突变的氨基酸序列的重链CDR3的氨基酸序列；
[0047] (ii)轻链可变区（VL)含有：
[0048] (a)包含序列号10的氨基酸序列、或者在其氨基酸序列中具有1个~数个氨基酸 残基的缺失、取代、插入和/或添加的突变的氨基酸序列的轻链CDRl的氨基酸序列、
[0049] (b)包含序列号11的氨基酸序列、或者在其氨基酸序列中具有1个~数个氨基酸 残基的缺失、取代、插入和/或添加的突变的氨基酸序列的轻链CDR2的氨基酸序列、以及
[0050] (c)包含序列号12的氨基酸序列、或者在其氨基酸序列中具有1个~数个氨基酸 残基的缺失、取代、插入和/或添加的突变的氨基酸序列的轻链CDR3的氨基酸序列。
[0051] [2]如[1]所述的人源化抗体或其抗原结合性片段，其中，
[0052] ⑴重链可变区（VH)含有：
[0053] (a)包含序列号7的氨基酸序列的重链⑶Rl的氨基酸序列、
[0054] (b)包含序列号8的氨基酸序列的重链⑶R2的氨基酸序列、以及
[0055] (c)包含序列号9的氨基酸序列的重链⑶R3的氨基酸序列；
[0056] (ii)轻链可变区（VL)含有：
[0057] (a)包含序列号10的氨基酸序列的轻链⑶Rl的氨基酸序列、
[0058] (b)包含序列号11的氨基酸序列的轻链⑶R2的氨基酸序列、以及
[0059] (c)包含序列号12的氨基酸序列的轻链⑶R3的氨基酸序列。
[0060] [3]如[1]或[2]所述的人源化抗体或其抗原结合性片段，其中，
[0061] ⑴重链可变区（VH)含有序列号43、44、45和46的氨基酸序列分别作为FR1、FR2、 FR3和FR4的氨基酸序列，其中，FR1、FR2、FR3和FR4的氨基酸序列可以分别在序列号43、 44、45和46的氨基酸序列中具有1个~数个氨基酸残基的缺失、取代、插入和/或添加的突 变，
[0062] (ii)轻链可变区（VL)含有序列号47、48、49和50的氨基酸序列分别作为FR1、 FR2、FR3和FR4的氨基酸序列，其中，FR1、FR2、FR3和FR4的氨基酸序列可以分别在序列号 47、48、49和50的氨基酸序列中具有1个~数个氨基酸残基的缺失、取代、插入和/或添加 的突变。
[0063] [4]如[1]~[3]中任一项所述的人源化抗体或其抗原结合性片段，其中，含有：
[0064] (i)在重链可变区（VH)中至少49位和94位这两个位置的氨基酸残基为来源于大 鼠抗体#10-22的H的氨基酸残基（均为丙氨酸）的氨基酸序列、
[0065] (ii)在轻链可变区（VL)中至少44位和46位这两个位置的氨基酸残基为来源于 大鼠抗体#10-22的L链的氨基酸残基（分别为异亮氨酸和精氨酸）的氨基酸序列。
[0066] [5]如[1]~[4]中任一项所述的人源化抗体或其抗原结合性片段，其中，含有：
[0067] (i)包含与序列号41的氨基酸序列具有90%以上的同一性的氨基酸序列的重链 可变区（VH)、以及
[0068] (ii)包含与序列号42的氨基酸序列具有90%以上的同一性的氨基酸序列的轻链 可变区（VL)。
[0069] [6]如[1]~[5]中任一项所述的人源化抗体或其抗原结合性片段，其中，含有：
[0070] ⑴包含序列号41的氨基酸序列的重链可变区（VH)、以及
[0071] (ii)包含序列号42的氨基酸序列的轻链可变区（VL)。
[0072] [7]如[1]~[6]中任一项所述的人源化抗体或其抗原结合性片段，其中，上述人 源化抗体的类别（亚类）为IgGl ( λ )或IgG2 ( λ )。
[0073] [8]如[1]~[7]中任一项所述的人源化抗体或其抗原结合性片段，其中，在 250ng/ml下比较对人HMGBl蛋白的结合活性（ELISA法）时，所述的人源化抗体或其抗原结 合性片段所具有的高活性为#10-22嵌合抗体的2倍以上。
[0074] [9]如[1]~[7]中任一项所述的人源化抗体或其抗原结合性片段，其中，将人 HMGBl蛋白与RAGE的结合抑制50%时的活性（IC50)为5 μ g/mL(约33nM)以下。
[0075] [10]如[1]~[7]中任一项所述的人源化抗体或其抗原结合性片段，其中，将人 PBMC的由HMGBl蛋白刺激引起的TNF- α释放抑制50%时的活性（IC50)为0. 02 μ g/mL (约 0. 13nM)以下。
[0076] [11] -种药物组合物，其含有[1]~[10]中任一项所述的人源化抗体或其抗原结 合性片段以及药学上可容许的载体。
[0077] [12]如[11]所述的药物组合物，其用于由从细胞游离出的HMGBl诱发的各种 HMGBl相关疾病的治疗或预防。
[0078] [13]如[11]所述的药物组合物，其用于疾病的治疗或预防，上述HMGBl相关疾病 为脑梗塞、脑水肿、脑血管痉挛、外伤性脑损伤、动脉粥样硬化、神经源性疼痛、败血症、关节 炎、急性肺外伤、脑缺血、肾缺血和肝缺血等中的任意一种。
[0079] [14]编码[1]~[10]中任一项所述的人源化抗体或其抗原结合性片段的氨基酸 序列的分离的核酸、或者在高严格条件下与这些核酸中的任意一种杂交的分离的核酸。
[0080] [15] -种重组表达载体，其整合有[14]所述的分离的核酸。
[0081] [16] -种宿主细胞，其导入有[15]所述的重组表达载体。
[0082] 发明效果
[0083] 本发明中使用的抗HMGBl的大鼠抗体在尚未确立充分的治疗法的脑梗塞、脑血管 痉挛、外伤性脑损伤、动脉粥样硬化和神经源性疼痛等的动物模型中，显示出可成为解开针 对这些相关疾病的治疗法、预防法上的问题的药剂的可能性，但由于为大鼠来源的抗体，因 此难以在临床中使用。通过在使该大鼠抗体维持抗原特异性的同时维持或提高亲和性、 中和活性而制成人源化抗体，使大鼠抗体的免疫原性减弱，由此，能够针对上述多种严重的 HMGBl相关疾病提供新的治疗法、预防法。
【附图说明】
[0084] 图1示出由#10-22杂交瘤克隆的抗体基因产物的与HMGBl的反应性。
[0085] 图2示出#10-22嵌合抗体的与HMGBl的反应性。
[0086] 图3分别示出