选为 42. 0%以上的人源化抗体或其抗原结合性片段包含在本发明中。
[0201] 以下，通过实施例更具体地对本发明进行说明，但本发明不受这些实施例的 任何限制。本实施例中使用的程序若非特别提及，则可以参考Molecular Cloning:A Laboratory Manual (第3版）（Sambrook等，冷泉港实验室出版社，2001)。
[0202] 实施例
[0203] 实施例1抗HMGBl大鼠单克隆抗体的制备
[0204] 本专利申请中使用的产生抗HMGBl抗原的大鼠抗体#10-22的杂交瘤细胞的获取 方法，公开在（W02007/049468、US2009/0252739 和 FASEB J，2007(21)p3904 等）中，以下记 述其要点。
[0205] (a)大鼠的免疫
[0206] 将市售的牛胸腺来源HMGBl与HMGB2的混合物（和光纯药工业公司制造，编号： 080-070741)与完全弗氏佐剂一同给药于大鼠的后肢足底，在2周后确认抗体效价的升高， 接着，在5周后从肿大的髂骨淋巴结在无菌条件下取出淋巴结细胞。
[0207] (b)细胞融合和抗HMGBl抗体产生细胞的克隆
[0208] 使用聚乙二醇使上述髂骨淋巴结细胞与小鼠骨髓瘤SP2/0_Agl4(SP2)细胞融合， 将所得到的融合细胞在96孔微孔板中培养，经过利用ELISA的一次筛选和利用蛋白免疫印 迹的二次筛选，克隆出抗HMGBl抗体产生细胞。
[0209] 实施例2抗体基因的克隆
[0210] (a)抗体基因克隆
[0211] 使用QIAamp RNA血液小量提取试剂盒（QIAGEN)从产生#10-22的杂交瘤细胞中 纯化总 RNA，接着，使用 Cells-to-cDNA II(Ambion)合成 cDNA。进而，使用 5' RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends，cDNA末端快速扩增）-PCR法，由所得到的cDNA使用各自的 引物进行PCR来扩增全长的H链和L链的抗体基因。将扩增得到的#10-22抗体的H链、L 链的基因片段克隆到真核细胞表达用载体中。
[0212] (b)克隆得到的#10-22的抗原结合性确认
[0213] 将编码H链、L链的质粒同时导入CHO-Kl细胞中。基因导入使用Lipofectamine LTX和plus试剂（Invitrogen)。2天后回收培养上清，与固相化于酶标板（Nunc， Maxisorp)上的牛胸腺来源的 HMGBl (Shino-Test，#326059683，100ng/孔）在室温下反 应1小时。接着，与HRP标记抗大鼠 IgG抗体（DAKO, P0450)在室温下反应1小时。添加 TMB(3, 3'，5, 5' -四甲基联苯二胺；SureBlue，KPL，#52-00-03)，通过 450nm 的吸光度确认 了培养上清中的抗体与HMGBl结合（图1)。
[0214] (c)基于碱基序列的#10-22的氨基酸序列的确定
[0215] 利用ABI测序仪确认#10-22的H链、L链的碱基序列。通过所得到的碱基序列， 确定#10-22的H链、L链的氨基酸序列。将包含信号序列的H链、L链的氨基酸序列示于序 列号1和2,将不含信号序列的H链、L链的氨基酸序列示于序列号3和4,将可变区（VH和 VL)的氨基酸序列示于序列号5和6。
[0216] 另外，抗体的互补决定区（O)R)的分析使用"Kabat的定义"（www. bioinf. org. uk:Dr. Andrew C. R. Mart in? s Group, Antibodies: General Information)。其中，关于 H链Q)R1，设定为由"Kabat的定义"和"Chothia的定义"（http: //www. bioinf. org. uk/ abs/#kabatnum)这两个定义覆盖的序列。将#10-22的H链的CDR1、CDR2和CDR3的氨基 酸序列示于序列号7、8和9,将L链的⑶R1、⑶R2和⑶R3的氨基酸序列示于序列号10、11 和12 〇
[0217] 实施例3嵌合抗体和人源化抗体的制作
[0218] (a) #10-22嵌合抗体的制作
[0219] 为了使大鼠抗体能够作为抗体药物使用，以保持抗体的抗原结合性且减轻免疫原 性为目的，利用抗体基因工程制作嵌合抗体和人源化抗体。首先，制作将大鼠抗体的恒定区 取代为人来源的氨基酸序列（IgGl(X))的嵌合抗体。所制作的嵌合抗体的抗原结合性通 过与大鼠抗体同样的方法来检测，确认维持了抗原结合性（图2)。将嵌合抗体的H链和L 链的氨基酸序列示于序列号13和14。
[0220] (b) #10-22嵌合抗体L链的人源化
[0221] 为了实现人源化，需要保留#10-22嵌合抗体的6个CDR区域（#10-22VL-CDRl/2/3 和#10-22VH-CDRl/2/3)，并将大鼠抗体#10-22来源的框架区（FR)重组为人FR(FR1、FR2、 FR3 和 FR4)。首先，使用 V-BASE (http: //vbase. mrc-cpe. cam. ac. uk/)和 Blast (http: // blast, ncbi. nlm. nih. gov)进行与#10-22嵌合抗体L链的FR序列的同源性高的候补人FR 序列的检索，选择出8种人来源的L链可变区序列（序列号15~24)。使用这些可变区的 氨基酸序列和#10-22嵌合抗体的氨基酸序列进行比对，选出未见于人FR序列中的"大鼠氨 基酸残基"，确定将这14个位置（5位、11位、14位、15位、17位、19位、41位、42位、44位、 46位、59位、60位、76位和77位）全部取代为上述8种人FR序列的共有序列的L链FR的 人氨基酸序列（Human_VL ;序列号25~28)(图3)。接着，分别制作对大鼠氨基酸残基部位 的14个位置逐个进行1个氨基酸残基取代的部位取代嵌合抗体（L链）（I5T、Al IV、T14S、 L15P、N17Q、V19A、D41G、K42Q、I44P、R46L、S59P、D60E、R76S 和 D77G)的基因。将所得到的 14种#10-22嵌合抗体（L链）的部位取代体基因分别与#10-22嵌合抗体（H链）基因同时 导入CHO-Kl细胞中。通过使用固相化有抗IgG抗体的酶标板的ELISA法对所制作的14种 抗体进行定量，使抗体浓度一致后，对抗原结合性进行考察。这些部位取代体中，L链可变 区内的I44P和R46L这2种部位取代体的抗原结合性均比嵌合抗体显著降低（图4)。需要 说明的是，取代部位的位置表示按照Kabat编号法。
[0222] 制作编码如下L链的人源化抗体（L链）基因嵌合抗体L链中44位、46 位和3个CDR序列原样保留大鼠抗体L链可变区来源的氨基酸序列，除此以外的可变区的 氨基酸序列全部重组为上述Human_VL的氨基酸序列。将所得到的#10-22人源化抗体（L 链）（以下称为EV007156L)基因和#10-22嵌合抗体（H链）基因同时导入CHO-Kl细胞中。 通过使用固相化有抗IgG抗体的酶标板的ELISA法对所制作的抗体进行定量，使抗体浓度 一致后，对抗原结合性进行考察。该抗体的抗原结合性与嵌合抗体相比为同等水平或稍见 提尚（图5)。
[0223] (c) #10-22嵌合抗体H链的人源化
[0224] 与L链同样地进行与#10-22嵌合抗体的H链FR序列的同源性高的候补人FR序 列的检索，选择6种人来源的H链序列（序列号29~34)，使用它们的可变区和大鼠抗体 #10-22来源H链可变区的氨基酸序列进行比对（图6)。选出未见于人FR序列中的"大鼠 氨基酸残基"的15个位置（1位、15位、16位、20位、41位、49位、76位、77位、78位、82a位、 82b位、89位、94位、107位和108位），确定将它们全部取代为上述6种人FR序列的共有序 列的H链FR的人氨基酸序列（Human_VH ;序列号35~38)(图6)。接着，分别制作对上述 嵌合抗体H链将位于FR序列上的非人氨基酸残基部位的15个位置逐个进行1个氨基酸残 基取代的部位取代嵌合抗体（H 链）（A1E、K15G、E16G、I20L、P41S、A49G、S76N、M77T、V78A、 D82aN、N82bS、M89V、A94R、V107T 和 M108L)的基因。将所得到的 15 种 #10-22 嵌合抗体（H 链）的部位取代体基因分别与EV007156L基因同时导入CHO-Kl细胞中。通过使用固相化 有抗IgG抗体的酶标板的ELISA法对所制作的15种抗体进行定量，使抗体浓度一致后，对 抗原结合性进行考察。这些部位取代抗体中，H链可变区内的A49G和A94R这2种部位取 代体的抗原结合性与由嵌合抗体（H链）基因和EV007156L基因的共表达得到的抗体相比 均显著降低（图7)。
[0225] 制作编码如下H链的人源化抗体（H链）基因嵌合抗体H链中49位、94 位和3个CDR序列原样保留大鼠抗体H链可变区来源的氨基酸序列，除此以外的H可变区 的氨基酸序列全部重组为上述Human_VH的氨基酸序列。将所得到的#10-22人源化抗体（H 链）（以下称为EV007156H)基因和EV007156L基因同时导入CHO-Kl细胞中。通过使用固 相化有抗IgG抗体的酶标板的ELISA法对所制作的抗体进行定量，使抗体浓度一致后，对抗 原结合性进行考察。该抗体的抗原结合性与由#10-22嵌合抗体（H链）基因和EV007156L 基因的共表达得到的抗体相比，观察到显著的提高（图8)。将#10-22人源化抗体（以下称 为EV007156)的H链和L链的全长氨基酸序列示于序列号39和40,将可变区的氨基酸序列 示于序列号41和42。另外，将H链可变区的FRl、FR2、FR3和FR4的氨基酸序列示于序列 号43、44、45和46,将L链可变区的FR1、FR2、FR3和FR4的氨基酸序列示于序列号47、48、 49 和 50。
[0226] 需要说明的是，为了评价#10-22嵌合抗体和EV007156对HMGBl的结合活性 (ELISA法），在将牛胸腺来源的HMGBl以25ng/孔的浓度在4°C下固相化过夜的酶标板 (Nunc、Maxisorp)中加入NlOl (日本油脂），将板封闭2小时后，以将#10-22嵌合抗体和 EV007156分别从4μg/ml起稀释4倍后得到的样品（7个浓度）作为一次抗体，在室温下反 应1小时。接着，使HRP标记抗人IgGy抗体（MBL，#208)在室温下反应1小时。加入TMB 后，通过450nm的吸光进行检测。其结果，使抗体浓度为250ng/ml时的人源化抗体EV007156 显示出比#10-22嵌合抗体高约5倍的抗原结合性。
[0227] 实施例4与各种HMGBl的结合性
[0228] (a)各种HMGBl的制备
[0229] (a-Ι)牛胸腺来源的HMGBl
[0230] 牛胸腺来源的HMGBl从Shino-Test公司或Chondrex公司获得。
[0231] (a-2)人来源的重组HMGBl (Sf9表达）
[0232] 人来源的重组HMGBl以N末端结合有His标签的形式从感染了杆状病毒的Sf9细 胞中纯化。即，使Sf9细胞感染表达HMGBl的杆状病毒后，旋转培养72小时，通过离心得到 细胞团块。然后，将细胞悬浊于含有蛋白酶抑制剂的缓冲液中，进行超声（1分钟X4次），将 细胞破碎。接着，以15000rpm离心15分钟，回收含有HMGBl的上清。使用QIAGEN Ni-NTA 吸附、纯化上清中含有的HMGB1，使用IOOmM咪唑洗脱，在磷酸缓冲液（PBS(-))中进行透析。
[0233] (a-3)核 HMGBl
[0234] 核 HMGBl 由在 10% FCS-DMEM 中培养的 CHO-Kl 细胞制作。即，在 10% FCS-DMEM、 5% C02、37°C的条件下培养CHO-Kl，在细胞密度达到铺满时将CHO细胞用PBS (-)清洗2次， 使用细胞刮（Nunc，#179693)刮取后，回收至离心沉淀管中。在细胞溶液中以达到0. 2%的 方式加入TritonX-100,通过超声进行细胞破坏。将溶液作为核型抗原。
[0235] (a-4)坏死 HMGBl
[0236] 坏死HMGBl由在10 % FCS-DMEM中培养的CHO-Kl细胞制作。即，在10 % FCS-DMEM、 5% C02、37°C的条件下培养CH0-K1，在细胞密度达到铺满时加入PBS(-)清洗2次。然后，加 入适量超纯水后，使用细胞刮刮取细胞。使用恒温槽和干冰，反复进行5次冷冻融化，将细 胞破坏，以12000rpm离心10分钟，将细胞肩除去。将上清作为坏死HMGB1，在-80°C保存。
[0237] (a-5)凋亡 HMGBl
[0238] 凋亡 HMGBl 由在 10% FCS-DMEM 中培养的 CHO-Kl 细胞制作。在 10% FCS-DMEM、 5% CO2、37°C的条件下培养CHO-Kl，在细胞密度达到铺满时对CHO细胞照射2分钟UV，置换 为无血清DMEM培养基后，回收培养16小时后的培养基。将通过离心除去细胞后的上清作 为凋亡HMGBl。
[0239] (a-6)继发坏死 HMGBl
[0240] 继发坏死HMGBl由在10% FCS-DMEM中培养的CHO-Kl细胞制作。在10% FCS-DMEM、 5% CO2、37°C的条件下培养CHO-Kl，在细胞密度达到铺满时对CHO细胞照射2分钟UV，置换 为无血清DMEM培养基。培养48小时后回收培养基，将通过离心除去细胞后的上清作为继 发坏死HMGBl。
[0241] (a-7)活化 HMGBl
[0242] 活化HMGBl由在10% FCS-RPMI中培养的RAW细胞（理研）制作。在10% FCS-RPMI、 5% C02、37°C的条件下培养RAW细胞，在细胞密度达到铺满时将RAW细胞用PBS (-)清洗2 次，置换为无血清RPMI培养基后，用I y g/ml的PolyIC进行刺激。回收刺激后24小时的 培养上清，将通过离心除去细胞后的上清作为活化HMGBl。
[0243] (b)利用蛋白免疫印迹得到的EV007156与各种HMGBl的结合性
[0244] 通过蛋白免疫印迹考察#10-22、其人源化抗体（EV007156)、S6 (MedImmune公司） 和G4 (MedImmune公司）的抗体对上述中制作的各种HMGBl的结合性。即，分别在牛胸腺来 源的HMGB1、Sf6表达重组人HMGB1、核HMGB1、坏死HMGB1、凋亡HMGB1、继发坏死HMGB1、活 化HMGB1中加入5 X SDS样品缓冲液，在95 °C下煮沸5分钟。将HMGB1样品的梯度稀释物在 12%聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳后，将蛋白质转印到PVDF膜上。使用5%脱脂奶粉-TBST封 闭2小时后，使#10-22、EV007156、S6和G4(各自为2 μ g/ml)在室温下反应1小时。接着， 使HRP标记的二次抗体在室温下反应1小时，使用ECL prime(GE Healthcare，RPN2232)进 行检测（表4)。需要说明的是，作为阳性对照抗体，对于W02007/001422记载的人抗HMGBl 抗体（S6和G4)，合成编码该专利中公开的氨基酸序列的基因，进行抗体产生、纯化，供于试 验。
[0245] [表 4]
[0246] 表4.抗体对各种抗原的结合性评价（蛋白免疫印迹）
[0248] HMGBl 抗体（#10-22、EV007156、S6、G4)对各种 HMGBl (牛胸腺、重组、核、坏死、凋 亡、继发坏死和活化HMGB1)的结合性评价。
[0249] -:未观察到结合、+ :观察到弱结合、++ :观察到强结合
[0250] (c) #10-22 嵌合抗体、EV007156 的抗原结合 ELISA
[0251] 在将上述人来源的重组HMGBl以25ng/孔的浓度在4°C下固相化过夜的酶标板 (Nunc，Maxisorp)中加入NlOl (日本油脂），将板封闭2小时后，以将#10-22嵌合抗体、 EV007156、S6和G4分别从4 μ g/ml起稀释4倍后得到的样品（7个浓度）作为一次抗体，在 室温下反应1小时。接着，使HRP标记抗人IgGy抗体（MBL，#208)在室温下反应1小时。 加入TMB后，通过450nm的吸光进行检测（图9的（A))。另外，将使抗体浓度为250ng/ml 时的各HMGBl抗体对各HMGBl (重组）的结合率示于图9的（B)。人源化抗体EV007156对 重组HMGBl显示出比#10-22嵌合抗体高约2. 5倍的抗原结合性。另外，EV007156对重组 HMGBl显示出比S6高45倍、比G4高22倍的结合性。
[0252] 实施例5结合抑制分析
[0253] RAGE结合抑制分析
[0254] 在将 RAGE-Fc(R&D，250ng/ 孔）在 4°C 下固相化过夜的酶标板（Nunc，Maxisorp) 中加入5%的BSA(Bovine Serum Albmin，牛血清白蛋白），将板封闭2小时后，加入人单克 隆抗体（Control Ig，对照Ig)，将板封闭2小时。在HMGBl (Sf6来源重组HMGB1，终浓度 2μg/ml)中，以使终浓度为（0μg/ml、0.02μg/ml、0.2μg/ml、2μg/ml、20μg/ml)的方式 混合抗HMGBl抗体（#10-22嵌合体、EV007156、G4)和作为阴性对照抗体的对HMGBl不具有 特异性的人单克隆抗体（Control Ig)，孵育60分钟。接着，将反应溶液加到酶标板中，反应 2小时。然后，使利用生物素标记试剂盒（Dojindo，LK03)进行了生物素化的抗HMGBl抗体 (Abnova，#H00003146-M08,1 μ g/ml)在室温下反应1小时。最后，使HRP标记链亲合素在室 温下反应1小时。加入了]\^(3,3'，5,5'-四甲基联苯二胺 ；511代81脱，即1^#52-00-03)，通 过450nm的吸光检测与RAGE结合的HMGBl (图10)。#10-22嵌合体、EV007156、G4均以依 赖于所添加的抗体浓度的方式抑制HMGBl与RAGE的结合。另外，该抑制效果在添加2 μ g/ ml的抗体时#10-22嵌合体为44. 0%、EV007156为46. 2%，与此相对，G4为1.4%。另外， 在添加20 μ g/ml的抗体的情况下，#10-22嵌合体为77. 0%、EV007156为58. 6 %，与此相 对，G4 为 36. 9%。另外，50%抑制浓度（IC50)在 #10-22 嵌合体为 3. 04 μ g/ml (20. 3nM)， 在EV007156 为4.05μg/ml(27nM)，在G4为20μg/ml(130nM)以上。因此可知，#10-22嵌 合体、EV007156对HMGBl与RAGE的结合的抑制效果显著强于G4。
[0255] 实施例6TNF-a释放抑制分析
[0256] 从正常