大鼠抗体#10-22的L链可变区、其人源化抗体（VLhuml〇-22)和人 FR (Human_VL)的氨基酸序列、以及与#10-22的L链FR序列的同源性高的8种人来源抗 体或种系（GenBank 登记号：Z73666、X97474、X97464、BAA20889、Z73647、AY701728、hLV3_ cons (人IGLV3家族的共有序列：W02011/080350)和JL2-germ (来源于人λ链几2种系的 序列））的L链可变区的氨基酸序列。本图中，对于作为#10-22的FR序列中在上述8种人 来源序列中未观察到的氨基酸残基"大鼠氨基酸残基"的14个位置（图中，在Human_VL序 列下用"H:human"或"R:rat"的记号表示），将它们全部取代为上述8种人FR序列的共有 序列而得到的FR序列为Human_VL。本图中，VLhuml〇-22表示人源化抗体（EV007156)的L 链可变区，44位和46位以外的FR氨基酸残基与上述Human_VL的序列相同。关于L链可变 区的1位（IS)，已知根据人抗体中使用的信号序列的种类在S1-Y2之间被切断，在本发明的 人FR(HumanJL)和人源化抗体（VLhuml〇-22)中，选择与大鼠抗体#10-20的L链可变区的 N末端同样地将"1S"切断的序列。需要说明的是，本图中的氨基酸残基的位置按照Kabat 的编号法（ http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/)来表不。
[0087] 图4示出#10-22嵌合抗体L链部位取代后的对HMGBl的结合性评价。使用固相 化有HMGBl的酶标板，通过ELISA法来实施。作为对照，使用#10-22嵌合抗体，算出将其OD 值设为100%时#10-22嵌合抗体L链部位取代体（14种）对HMGBl的结合率。
[0088] 图5示出#10-22嵌合抗体L链人源化后的抗体对HMGBl的结合性评价。使用固 相化有HMGBl的酶标板，通过ELISA法来实施。作为对照，使用#10-22嵌合抗体，算出将其 OD值设为100 %时#10-22 (L链）人源化抗体（EV007156L)与#10-22嵌合抗体（H链）共 表达而得到的抗体对HMGBl的结合率。
[0089] 图6分别示出大鼠抗体#10-22的H链可变区、其人源化抗体（VHhuml〇-22)和人 FR (Human_VH)的氨基酸序列、以及与#10-22的H链FR序列的同源性高的6种人来源抗体或 种系（GenBank 登记号：AM940224、DQ926386、FJ488688、HM855402、DQ840895 和 Z12332)的 H链可变区的氨基酸序列。本图中，对于作为大鼠抗体#10-22的FR序列中在上述6种人来 源序列中未观察到的氨基酸残基"大鼠氨基酸残基"的15个位置（图中，在Human_VL序列 下用"H:human"或"R:rat"的记号表示），将它们全部取代为上述6种人FR序列的共有序 列而得到的FR序列为Human_VH。本图中，VHhuml〇-22表示人源化抗体（EV007156)的L链 可变区，49位和94位以外的FR氨基酸残基与上述Human_VH的序列相同。需要说明的是， 本图中的氨基酸残基的位置按照Kabat的编号法（http://vbase. mrc-cpe. cam. ac. uk/)来 表不。
[0090] 图7示出#10-22嵌合抗体H链部位取代后的对HMGBl的结合性评价。使用固相 化有HMGBl的酶标板，通过ELISA法来实施。作为对照，使用#10-22嵌合抗体的H链，算出 将其OD值设为100%时#10-22嵌合抗体H链部位取代体（15种）对HMGBl的结合率。
[0091] 图8示出#10-22嵌合抗体人源化后的对HMGBl的结合性评价。使用固相化有 HMGBl的酶标板，通过ELISA法来实施。作为对照，使用#10-22嵌合抗体的H链，算出将其 OD值设为100%时#10-22人源化抗体（EV007156)对HMGBl的结合率。
[0092] 图 9 示出抗 HMGBl 抗体（#10-22 嵌合抗体、EV007156、S6、G4)对重组 HMGBl (Sf9 细胞来源）的结合性评价。使用固相化有HMGBl的酶标板，通过ELISA法来实施（A)。对于 各HMGBl (牛胸腺来源和Sf9细胞来源），以EV007156的OD值为基准，算出抗体浓度250ng/ ml下的各HMGBl抗体的结合性⑶。〇：#10-22嵌合体、:EV007156、A :S6、0 :G4
[0093] 图10示出抑制抗HMGBl抗体与RAGE的结合的效果。根据由ELISA得到的OD值对 HMGBl量进行定量后，将结合抑制分析中使用的HMGBl量（2 μ g/ml)设为100%，算出HMGBl 与RAGE的结合率。〇：#10-22嵌合体、:EV007156、D :G4、·：对照Ig
[0094] 图11示出抗HMGBl抗体对PBMC的由HMGBl引起的TNF- α释放诱导活性的抑制 效果。将由外周血得到的PBMC用HMGBl进行刺激，对24小时后得到的培养上清中含有 的 TNF-α 的量进行定量（eBioscience、Human TNF-α Ready-Set-Go ! )。·：阴性对照 (EV2001)、▲ :EV007156、* :S6、〇：G4
[0095] 图12示出使用EV007156的小鼠体内的药物动态试验的结果。将EV007156以 10mg/kg腹腔内给药于C57BL/6N，利用ELISA对在给药后0. 25天、给药后3天、7天、14天、 24天采集的血液中含有的EV007156进行定量。〇：利用抗人IgG固相的EV007156的定量、 ?:利用HMGBl固相的EV007156的定量
[0096] 图13示出HMGBl的结构域和制成的缺失构建体。各结构域的氨基酸范围为-30~ 0 :His 标签和接头、1 ~88 :A-Box、89 ~185 :B-Box、186 ~125 :C-tail :186 ~125(数字 为自蛋氨酸起的氨基酸数）。分别示出附加有His标签的全长HMGBl和6种缺失构建体的 构成结构域。
[0097] 图14示出制成的缺失构建体的利用抗His抗体的表达确认试验的结果。将附加有 His标签的全长HMGBl和6种缺失构建体转染到CHO-Kl中，使用抗His抗体进行染色，确认 各缺失构建体的表达。A~H分别表示A :CH0-K1、B !His-HMGBl (全长）、C :A-Box+B-Box、 D :A-Box+C_tail、E :B-Box+C_tail、F :A_Box、G :B_Box、H :+C_tail〇
[0098] 图15示出制成的缺失构建体的利用CBB染色的表达确认试验的结果。将附加有 His标签的全长HMGBl和6种缺失构建体转染到CHO-Kl中，制备细胞裂解液后，使用Ni-琼 脂糖对表达的蛋白质进行纯化。将各蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中电泳，使用CBB进行染色。
[0099] 图16-a示出利用免疫荧光染色法得到的EV007156的表位作图。将全长HMGBl和 6种缺失构建体转染到CHO-Kl中，使用EV007156进行染色，考察EV007156识别何种缺失构 建体。A ~H 分别表示 A :CH0-K1、B :His-HMGBl (全长）、C :A-Box+B-Box、D :A-Box+C-tail、 E :B-Box+C_tail、F :A_Box、G :B_Box、H :+C_tail〇
[0100] 图16-b示出利用免疫荧光染色法得到的S6的表位作图。将全长HMGBl和6种缺 失构建体转染到CHO-Kl中之后，使用S6进行染色，考察其识别何种缺失构建体。A~H分别 表示 A :CH0-K1、B :His-HMGBl (全长）、C :A-Box+B-Box、D :A-Box+C-tail、E :B-Box+C-tail、 F :A_Box、G :B_Box、H :+C_tail〇
[0101] 图16-C示出利用免疫荧光染色法得到的G4的表位作图。将全长HMGBl和6种缺 失构建体转染到CHO-Kl中之后，使用G4进行染色，考察其识别何种缺失构建体。A~H分别 表示 A :CH0-K1、B :His-HMGBl (全长）、C :A-Box+B-Box、D :A-Box+C-tail、E :B-Box+C-tail、 F:A-Box、G:B-Box、H:+C_tail〇
[0102] 图17-a示出利用蛋白免疫印迹得到的EV007156的表位作图。将全长HMGBl和各 缺失构建体在聚丙烯酰胺凝胶中电泳，使用EV007156进行检测。
[0103] 图17-b示出利用蛋白免疫印迹得到的S6的表位作图。将全长HMGBl和各缺失构 建体在聚丙烯酰胺凝胶中电泳，使用S6进行检测。与EV007156不同，识别到含有B-Box的 区域。
[0104] 图17-c示出利用蛋白免疫印迹得到的G4的表位作图。将全长HMGBl和各缺失构 建体在聚丙烯酰胺凝胶中电泳，使用G4进行检测。与EV007156不同，识别到含有B-Box的 区域。
[0105] 图18示出利用HMGBl的C末端区域的合成肽得到的EV007156的表位作图。合成 #1~#10这10种肽，通过斑点印迹法检测EV007156识别何种肽。形成斑点的肽量一律为 4 μ g/斑点。
[0106] 图19示出使用败血症模型小鼠的通过给药EV007156得到的致死防御效果。对实 施了 CLP的小鼠以10mg/kg给药EV007156,算出至术后6天为止的存活率。?：阴性对照 组、▲ :EV007156给药组
【具体实施方式】
[0107] L术语的说明
[0108] 本说明书中，与本发明相关地使用的科学术语和专业术语具有本领域技术人员通 常理解的含义。此外，若非在根据上下文判断为特别必要的情况下，则单数术语包含复数， 复数术语包含单数。一般而言，本说明书中记载的与细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、 微生物学、遗传学、蛋白质与核酸化学以及杂交的技术相关地使用的命名法为该领域中公 知且通常使用的命名法。
[0109] 本发明涉及与HMGBl蛋白特异性结合、对HMGBl相关疾病的治疗、预防有效的人源 化抗HMGBl抗体及其抗原结合性片段。以下，通过明确本发明中使用的语句的含义来详细 地对本发明的【具体实施方式】进行说明。
[0110] DHMGBl 蛋白
[0111] HMGBl蛋白（或者，有时称为"HMGB1多肽"）被认为具有染色质结构的维持功能、 转录活性调节功能等，但在作为败血症中的迟发型炎症介质被重新发现之后，陆续发现其 在各种疾病的炎症性细胞因子级联反应中担负重要的作用。HMGBl的结构为由富含赖氨酸 残基的215个氨基酸构成的25kDa的蛋白质，具有在哺乳动物间非常高度地保守的氨基酸 序列。其结构由3个结构域构成，这3个结构域由被称为A-box和B-box的2个DNA结合 结构域、以及仅由天冬氨酸和谷氨酸构成的羧基末端结构域（也称为C末端结构域或酸性 尾部）构成。A-box和B-box分别由彼此高度保守的约80个氨基酸残基构成，带有强正电。 Β-box 中存在 TLR4(toll_like receptor 4)结合结构域、RAGE(receptor for advanced glycation end products)结合结构域。通过HMGBl与TLR4的结合，诱导炎症性细胞因子 从巨噬细胞/单核细胞的分泌。需要说明的是，在最近的研宄中表明，关于由HMGBl在体外 弓丨起的TNF-α等细胞因子的分泌诱导，作为HMGBl的受体，有TLR4/MD2(髓样分化蛋白2) 复合体以及CD14的参与（Mol. Med. ,2013 (vol. 19) p88)。另一方面，通过HMGBl与RAGE的 结合，诱导内皮细胞和其他体细胞（包括肿瘤细胞）的增殖、分化、游走、细胞表面蛋白质的 表达。第三结构域、羧基末端具有由仅含天冬氨酸和谷氨酸残基的30个氨基酸序列构成的 结构，极端地带有负电。关于该C末端部分的氨基酸序列，已知在哺乳动物间也仅存在2-3 个位置的差异，是高度保守的。特别是关于HMGBl的RAGE结合结构域已揭示，在由缺血引 起的脑损伤（非专利文献2)和细菌感染所伴随的败血症（非专利文献3)等疾病中，通过 抑制HMGBl与RAGE受体的结合，能够抑制HMGB1-RAGE介导的HMGBl相关疾病中的炎症反 应的增强。
[0112] 本说明书中使用的HMGBl为哺乳动物来源的HMGBl (例如，人HMGB1、牛胸腺HMGBl 和啮齿类来源的HMGBl等），关于它们的氨基酸序列，公开在GenBank登记号CAG33144、 GenBank 登记号 CAE48262、GenBank 登记号 CAI15600、NCBI 参考序列登记号 NP_002119 和 UniProtKB/Swiss-Prot 登记号 P09429(以上为人来源）、GenBank 登记号 BC102929(牛胸 腺来源）、GenBank 登记号 EGV93351 (CH0-K1 细胞来源）和 UniProtKB/Swiss-Prot 登记号 P63159(大鼠来源）等中。本发明的抗体与存在于HMGBl蛋白的C末端结构域的氨基酸序 列（(EEEDDDDE(序列号60))特异性结合。不仅在人来源HMGBl中，而且在上述牛胸腺来源、 CHO来源和大鼠来源HMGBl的C末端，也存在与序列号60完全相同的氨基酸序列。
[0113] 2) HMGBl 相关疾病
[0114] HMGBl最初被认为具有染色质结构的维持功能、转录活性调节功能、DNA修复功能 等，但特别是在1999年以后作为败血症中的迟发型炎症介质被重新发现之后，陆续发现其 在各种疾病的炎症性细胞因子级联反应中担负重要的作用。HMGBl参与的炎症性细胞因子 级联反应成为包括炎症和凋亡在内的多种障碍的有害特性的原因之一，认为其参与如下所 述的HMGBl相关疾病（HMGBl-related disease)。虽然并非全部，但例如特别为：（i)在属于 炎症性疾病和自身免疫疾病的病症中，有风湿性关节炎/血清反应阴性关节症、变形性关 节炎、炎症性肠疾病、克罗恩病、肠梗阻、系统性红斑狼疮、虹膜炎/葡萄膜炎、视神经炎、特 发性肺纤维化、全身性血管炎/韦格纳肉芽肿、结节病、睾丸炎/输精管切除术、全身性硬化 症和硬皮病。（ii)在全身性炎症反应综合征中，有败血症综合征（包括革兰氏阳性菌败血 症、革兰氏阴性菌败血症、培养阴性败血症、真菌性败血症、发热性中性粒细胞减少、尿路败 血症、败血症结膜炎）、脑膜炎菌血症、外伤性出血、口吃、电离放射线暴露、急性和慢性前列 腺炎、急性和慢性胰腺炎、阑尾炎、消化道、胃和十二指肠溃疡、腹膜炎、溃疡性、伪膜性、急 性和缺血性结肠炎、憩室炎、弛缓不能、胆管炎、胆囊炎、肠炎、成人呼吸窘迫综合征（ARDS)。 (iii)在再灌注损伤中，有泵衰竭后综合征和缺血再灌注损伤。在心血管疾病中，有心源性 晕厥综合征、心肌梗塞和缺血、动脉粥样硬化、静脉血栓症、心内膜炎、心膜炎、充血性心力 衰竭和再狭窄。（ iv)在产科和妇科疾病中，有早产、子宫内膜异位症、流产、阴道炎和不孕 症。（V)在感染性疾病中，有HIV感染/HIV周围神经病变、脑膜炎、乙型和丙型肝炎、单纯 疱瘆病毒感染、败血症性关节炎、腹膜炎、大肠杆菌〇157:H7、肺炎会厌炎、溶血性尿毒症综 合征/血栓性血小板减少性紫癜、念珠菌病、丝虫病、阿米巴病、疟疾、登革出血热、利什曼 病、麻风病、毒素性休克综合征、链球菌肌炎、气性坏疽、人型结核杆菌、细胞内鸟型结核杆 菌、卡氏肺孢子虫肺炎、骨盆内炎症性疾病、睾丸炎/附睾炎、军团菌病、莱姆病、甲型流感 病毒、EB病毒、巨细胞病毒、病毒相关性噬血细胞综合征、病毒性脑炎/无菌性脑膜炎。（Vi) 在过敏性和特应性疾病中，有哮喘、过敏、过敏性休克、免疫复合物病、花粉症、过敏性鼻炎、 湿瘆、过敏性接触性皮炎、过敏性结膜炎、过敏性肺炎。（vii)在恶性肿瘤（液态和固体肿瘤 的病症）中，有ALL、AML、CML、CLL、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、卡波氏肉瘤、结直肠癌、鼻咽 癌、恶性组织细胞病和副肿瘤综合征/恶性高钙血症。（viii)在移植病中，有器官移植排斥 反应和移植物抗宿主病。（ix)在先天性疾病中，有囊性纤维化、家族性噬红细胞性淋巴组织 细胞增多症和镰刀形红细胞贫血。（X)在皮肤疾病中，有银肩病、银肩病关节炎和脱发。在神 经疾病中，有神经变性疾病（多发性硬化症、偏头痛、头痛、淀粉样蛋白相关病症、朊病毒病 /克雅氏病、阿尔海默茨病和帕金森病、多发性硬化症、肌萎缩性脊髓侧索硬化症）和周围 神经病、偏头痛、头痛。（xi)在肾疾病中，有肾病综合征、血液透析和尿毒症。（xii)在医源 性中毒状态中，有0KT3疗法、抗CD3疗法、细胞因子疗法、化学疗法、放射线疗法和慢性水杨 酸盐中毒。（xiii)在代谢性或突发性疾病中，有威尔逊氏病、血色素沉积症、α-l抗胰蛋白 酶缺乏症、糖尿病和糖尿病并发症、体重下降、食欲不振、恶病质、肥胖、桥本氏甲状腺炎、骨 质疏松症、下丘脑-垂体-肾上腺系的评价和原发性胆汁性肝硬化。（xiv)在眼科疾病中，有 青光眼、视网膜病和干眼症。（XV)在其他病症的杂集中，有多器官衰竭综合征、肌营养不良 症、败血症性脑膜炎、动脉粥样硬化、会厌炎、惠普尔病、哮喘、过敏、过敏性鼻炎、器官坏死、 发热、败血症、内毒素休克、高热症、嗜酸性粒细胞肉芽肿、肉芽肿病、结节病、感染流产、尿 道炎、肺气肿、鼻炎、肺泡炎、支气管炎、咽炎、上皮屏障功能障碍、尘肺、胸膜炎、鼻窦炎、流 感、呼吸道合胞病毒感染、播散性菌血症、包虫病、皮肌炎、烧伤、晒伤、荨麻瘆、疣（warst)、 风团、血管炎、脉管炎、心肌炎、动脉炎、结节性动脉周围炎、风湿热、脂泻病、脑炎、脑塞栓、 格林-巴利综合征、神经炎、神经痛、医源性并发症/末梢神经病变、脊髓损伤、麻痹、葡萄膜 炎、关节炎、关节痛、骨髓炎、肌膜炎、佩吉特氏病、痛风、牙周病、滑膜炎、重症肌无力、古德 帕斯彻氏综合征、白塞氏综合征、强直性脊椎炎、伯格氏病、莱特尔综合征、大疱性皮炎（大 疱性类天疱疮）、类天疱疮和寻常性天疱疮和脱发。
[0115] 近年来已阐明，HMGBl不仅局限于细胞的核内，而且伴随巨噬细胞、各种免疫系统 细胞的活化从核内向细胞质转移并向HMGBl细胞外释放（主动释放），或者，伴随由缺血、损 伤引起的细胞的坏死，局限于核内的HMGBl被迅速释放（被动释放）。即，认为这些HMGBl 参与的疾病（HMGB1相关疾病：HMGBl-related disease)大致分为两类。一类为败血症休克 这样与由微生物感染引起的免疫应答类似的疾病组，此时，伴随免疫细胞的活化，在炎症反 应的后期观察到HMGBl的细胞外分泌。另一类为脑梗塞这样起因于由非微生物性原因（例 如，缺血、外伤等）引起的细胞损伤等的疾病组，伴随细胞损伤，观察到迅速的HMGBl的细胞 外释放，由此产生各种细胞因子类。在前者的情况下，例如为从因感染而活化的单核细胞、 巨噬细胞等的主动的HMGBl的分泌，作为后期的炎症介质起作用。作为相关疾病，可以列举 败血症、关节炎、动脉粥样硬化、各种感染症和各种免疫疾病等。后者为如下情况：伴有由缺 血、外伤引起的细胞坏死，在此之前存在于核中的HMGBl在数小时