利用活性炭通过调整溶液条件来从蛋白混合物选择性地去除蛋白的制作方法
【专利说明】利用活性炭通过调整溶液条件来从蛋白混合物选择性地去 除蛋白
[0001] 相关申请的夺叉引用
[0002] 本申请要求2013年2月26日提交的美国临时专利申请第61/769, 269号的优先 权，其整体援引加入本文。
技术领域
[0003] 本发明涉及通过调整溶液条件利用活性炭从不期望的蛋白或蛋白杂质分离蛋白。
【背景技术】
[0004] 活性炭以前已用于空气过滤器（参见例如，美国专利第6, 413, 303号）、气体净 化（参见例如，美国专利第7, 918, 923号）、脱咖啡因（参见例如，美国专利第4, 481，223 号）、黄金提纯（参见例如，美国专利第5, 019, 162号）、燃料纯化（参见例如，美国公开 第2006/0223705 Al号）、血液灌流（参见例如，美国专利第4, 048, 064号）、中毒和过量 用药的治疗（参见例如，美国专利第4, 453, 929号）、污水处理（参见例如，美国专利第 8, 329, 035号）、漏油清理（参见例如，美国专利第4, 770, 715号）、地下水修复（参见例 如，美国专利第6, 116, 816号）、从汽车染料系统捕获挥发性有机化合物（参见例如，美国 专利第7, 044, 112号）、化学纯化（参见例如，美国专利第4, 906, 445号），蒸馏酒精饮料 纯化（参见例如，美国公开第US 2007/0248730 Al号）、糖的脱色（参见例如，每个专利第 2, 082, 425号）、口罩（参见例如，美国专利第5, 714, 126号）、防毒面具（参见例如，美国专 利第4, 992, 084号）、防护防化服（参见例如，美国专利第7, 877, 819号）以及水净化过程 (参见例如，美国专利第7, 537, 695号）。
[0005] 此外，活性炭已用来从血清白蛋白去除小分子杂质如脂肪酸和胆红素（参 见例如，Chen et al.，J. Biol. Chem. ,242:173-181 (1967) ;Nakano et al·，Anal Biochem·，129:64-71 (1983) ;Nikolaev et al.，Int.J. Art. Org. ,14:179-185(1991))。活 性炭还已用来在植物病毒的纯化期间去除色素以及宿主蛋白、蛋白酶和核糖核酸酶（参见 例如，Price，Am.J.Botany，33:45_54(1946) ;Corbett，Virology，15:8-15(1961) ;McLeana et al.，Virology，31:585-591 (1967),美国公开第 US 2006/0281075 Al 号）。
[0006] 此外，以前已描述活性炭可用于从质粒DNA去除低分子量质粒片段。参见，Kim et al.，J. Biosci. Bioeng. 110:608-613 (2010) 〇
【发明内容】
[0007] 本发明至少部分是基于令人惊讶和出人意料的发现，活性炭可以用于利用接近待 选择性地去除的蛋白的等电点的溶液条件从包含至少两种蛋白的混合物选择性地去除蛋 白。
[0008] 在一些实施方案中，提供一种从包含至少两种蛋白的样品选择性地去除蛋白的方 法，其中所述方法包括以下步骤：(a)提供包含至少两种蛋白的样品；(b)调整所述样品的 溶液pH，使得pH在待选择性地去除的蛋白的等电点的2. OpH单位内；（c)使所述样品与活 性炭接触，其中所述活性炭结合待选择性地去除的蛋白；以及（d)从所述样品去除所述活 性炭，由此从所述样品选择性地去除所述活性炭结合的蛋白。
[0009] 在一些实施方案中，如本文所述，从样品选择性地去除蛋白的方法中使用的溶液 pH在待选择性地去除的蛋白的等电点的1.0 pH单位内。
[0010] 在一些实施方案中，提供一种增加包含靶蛋白和至少一种不期望蛋白的样品中所 关注的靶蛋白的纯度的方法，其中所述方法包括以下步骤：(a)提供包含所述靶蛋白和至 少一种不期望蛋白的样品；(b)调整所述样品的溶液pH，使得所述pH在所述至少一种不期 望蛋白的等电点的2. OpH单位内；（c)使所述样品与活性炭接触，其中所述活性炭结合至少 一种不期望蛋白；以及（d)从所述样品去除结合所述至少一种不期望蛋白的活性炭，由此 增加所述样品中所述靶蛋白的纯度。
[0011] 在一些实施方案中，如本文所述，增加包含靶蛋白和至少一种不期望蛋白的样品 中靶蛋白的纯度的方法中使用的溶液PH在所述不期望蛋白的等电点的LOpH单位内。
[0012] 在一些实施方案中，至少一种不期望的蛋白为蛋白杂质。
[0013] 在一些实施方案中，所述靶蛋白为免疫球蛋白如抗体。在一些实施方案中，所述抗 体为单克隆抗体。在其他实施方案中，其为多克隆抗体。
[0014] 在一些实施方案中，所述靶蛋白为非免疫球蛋白。
[0015] 在一些实施方案中，包含至少两种蛋白的样品是源自细胞培养物的水溶液。
[0016] 在一些实施方案中，所述细胞培养物为中国仓鼠卵巢（CHO)细胞培养物。
[0017] 细胞培养物样品的其他实例包括但不限于HeLa细胞、NTH 3T3细胞、BHK细胞、 VERO细胞、CV-I细胞、NS/0细胞、COS细胞、幼仓鼠肾细胞、小鼠骨髓瘤、杂交瘤细胞、细菌 细胞、酵母细胞、昆虫细胞、两栖动物细胞、人细胞、小鼠细胞、大鼠细胞、狗细胞、猴细胞、山 羊细胞、猪细胞、牛细胞、马细胞、狗细胞、猫细胞、兔细胞、鸟细胞、猴细胞、仓鼠细胞、非人 哺乳动物细胞。
[0018] 在一些实施方案中，包含蛋白的样品可以是全细胞培养物进料。在其他实施方案 中，在与活性炭接触之前首先将细胞培养物澄清和/或纯化。澄清方法包括但不限于离心、 沉降、深层或筛过滤、与絮凝剂配合以及pH改变。
[0019] 在一些其他实施方案中，所述样品可以源自人、动物、或者植物组织或动物流体， 例如人血液或血浆、人组织、动物血液、山羊奶、牛奶、哺乳动物乳汁、动物器官、动物组织、 转基因动物、转基因植物和鸡蛋。
[0020] 在其他实施方案中，所述蛋白样品通过从氨基酸或较小的肽化学合成产生。
[0021] 在一些实施方案中，在使所述样品进行本文所述方法之前使所述样品进行一个或 多个纯化步骤或方法。这类纯化步骤或方法包括但不限于以结合和洗脱或者流过模式操作 的柱和/或膜色谱；结晶；两相或三相分配；以及过滤。
【附图说明】
[0022] 图1为示出代表性实验结果的图，其证实当溶液pH接近细胞色素 C的等电点时， 利用活性炭从细胞色素 C和α -乳清蛋白的混合物（I: 1重量比）选择性地去除细胞色素 C，相反地，当溶液pH接近α-乳清蛋白的等电点时，从所述混合物选择性地去除α-乳清 蛋白。X-轴示出溶液pH，而Y-轴示出用活性炭处理之后蛋白混合物中蛋白的百分比。
[0023] 图2为示出代表性实验结果的图，其证实利用活性炭在pH 4. 0、5. 0、6. 0、7. 0、8. 0 和9.0下于静态条件下从包含细胞色素 C和靶蛋白（即，单克隆抗体（Mb I))的混合物去 除的细胞色素 C的对数减少值（LRV)。所述混合物包含5. Omg/mL的Mb I和lmg/mL的细 胞色素 C(200, OOOppm)。如图3所示，当溶液pH最接近在pH 10. 0-10. 5的细胞色素 C的等 电点时，观察到利用活性炭最佳去除细胞色素 C。X-轴示出溶液pH，而Y-轴示出细胞色素 C 的 LRV0
[0024] 图3为示出代表性实验结果的图，其证实利用活性炭在pH 4. 0、5. 0、6. 0、7. 0、8. 0 和9.0下于静态条件下从包含α-乳清蛋白和靶蛋白（即，单克隆抗体（Mb I))的混合物 去除的α -乳清蛋白的对数减少值（LRV)。所述混合物包含5. Omg/mL的Mb I和lmg/mL 的α -乳清蛋白（200, OOOppm)。如图3所示，当溶液pH最接近在4. 8的α -乳清蛋白的等 电点时，观察到利用活性炭最佳去除α-乳清蛋白。X-轴示出溶液ΡΗ，而Y-轴示出α-乳 清蛋白的LRV。
[0025] 图4为示出代表性实验结果的图，其证实利用活性炭在pH 4. 0、5. 0、6. 0、7. 0、8. 0 和9.0下于静态条件下从包含溶菌酶和靶蛋白（即，单克隆抗体（Mb I))的混合物去除 的溶菌酶的对数减少值（LRV)。所述溶液包含5. Omg/mL的Mb I和1.0 mg/mL的溶菌酶 (200, OOOppm)。如图4所示，当溶液pH最接近11. 2-11. 3的溶菌酶等电点时，在pH 9. 0下 去除最大量的溶菌酶。X-轴示出溶液pH，而Y-轴示出溶菌酶的LRV。
[0026] 图5为示出代表性实验结果的图，其证实利用活性炭在pH 4. 0、5. 0、6. 0、7. 0、8. 0 和9.0下于静态条件下从包含BSA和靶蛋白（即，单克隆抗体（Mb I))的混合物去除的BSA 的对数减少值（LRV)。所述溶液包含5. Omg/mL的Mb I和(λ 5mg/mL的BSA(100, OOOppm)。 如图5所示，当溶液pH最接近4. 9的BSA等电点时，在pH 5. 0下去除最大量的BSA。X-轴 示出溶液pH，而Y-轴示出BSA的LRV。
[0027] 图6为示出代表性实验结果的图，其证实当在远离不期望的蛋白的等电点的溶液 pH下流过活性炭时，未有效地去除不期望的蛋白。该图示出pH 4. 0的5. Omg/mL的α -乳 清蛋白和0. 5mg/mL的细胞色素 C的溶液通过活性炭柱之后收集的12. 5mL部分中细胞色 素 C和α-乳清蛋白的浓度。在它们进入柱的大约相同的比例下，从柱洗脱出较低浓度的 细胞色素 C和较高浓度的α-乳清蛋白。如图6所示，在远离pH 10. 0-10. 5的细胞色素 C 等电点的PH 4.0下，活性炭不提供从细胞色素 C和α-乳清蛋白的溶液有效去除细胞色素 c。X-轴示出以kg/L计的α-乳清蛋白的装载；左边Y-轴示出以g/L计的细胞色素 C的 浓度，而右边Y-轴示出以g/L计的α -乳清蛋白的浓度。
[0028] 图7为示出代表性实验结果的图，其证实当在接近不期望的蛋白的等电点的溶液 pH下流过活性炭时，非常有效地去除不期望的蛋白。该图示出pH 9. 0的5. Omg/mL的α -乳 清蛋白和0. 5mg/mL的细胞色素 C的溶液通过活性炭柱之后收集的12. 5mL部分中细胞色素 C和α-乳清蛋白的浓度。细胞色素 C未突破柱，直至其已装载1.09kg的α-乳清蛋白/ 升活性炭。如图7所证实的，活性炭提供从pH 9.0(接近pH 10.0-10. 5的细胞色素 C等电 点）的α-乳清蛋白溶液极好地去除细胞色素 C。X-轴示出以kg/L计的α-乳清蛋白的 装载；左边Y-轴示出以g/L计的细胞色素 C的浓度，而右边Y-轴示出以g/L计的α -乳清 蛋白的浓度。
【具体实施方式】
[0029] 本发明提供新的和改良的方法用于在接近待选择性地去除的蛋白的等电点的溶 液条件下利用活性炭从至少两种蛋白的混合物选择性地去除蛋白。
[0030] 活性炭以前已用于水纯化方法。此外，活性炭已用来从血清白蛋白去除小分子 杂质如脂肪酸和胆红素（参见例如，Chen et al.，J.Biol. Chem. ,242:173-181(1967); Nakano et al., Anal Biochem.,129:64-71 (1983) ；Nikolaev et al.,Int.J.Art. Org.，14:179-185 (1991))。活性炭还已用来在植物病毒的纯化期间去除色素以及 宿主蛋白、蛋白酶和核糖核酸酶（参见例如，Price，Am.J.B 〇tany，33:45-54(1946); Corbett, Virology, 15:8-15(1961) ；McLeana et al. , Virology, 31:585-591 (1967)〇
[0031] 此外，整体援引加入本文的2012年8月2日提交的美国专利申请第13/565,463 号描述了活性炭联合其他介质在从包含所关注的生物分子（例如，抗体）的样品去除蛋白 杂质（例如，宿主细胞蛋白）中的用途。
[0032] 因此，总体上已报道活性炭非特异性地结合溶液中的分子（例如，水样品中的杂 质）。
[0033] 本发明至少部分是基于令人惊讶和出人意料的发现，活性炭可以用于通过调整溶 液条件，使得溶液的PH接近待选择性地去除的蛋白的等电点，来从包含两种或更多种蛋白 的混合物选择性地去除蛋白。
[0034] 如本文实施例中证实的，活性炭可以用于从两种或更多种蛋白的混合物选择性地 去除蛋白。此外，如本文所示实施例中证实的，可以通过改变PH条件来操作去除蛋白的程 度。此外，如本文所述，活性炭可以用来增加包含靶蛋白以及一种或多种不期望蛋白的溶液 中靶蛋白的纯度，其中利用活性炭选择性地去除一种或多种不期望蛋白并留下靶蛋白，由 此增加样品中靶蛋白的纯度。
[0035] 在本文所述的一些实施方案中，以流过纯化模式使用活性炭以从蛋白的混合物选 择性地去除蛋白。
[0036] 为了可以更容易地理解本公开，首先定义某些术语。额外的定义在整个详细说明 书中示出。
[0037] I.宙义
[0038] 如本文所用，术语"含碳物质"指由碳组成或包含碳的任何物质。在一些实施方案 中，本发明的方法中使用的含碳物质为活化碳或活性碳。在一些实施方案中，活性炭包含活 性木炭。在一些实施方案中，将活性炭掺入纤维介质。纤维介质可以通过本领域已知的许多 方法进行制备，包括湿法成网和干法成网。纤维介质通常包含活性炭、纤维组分和任选存在 的粘合剂。纤维介质的纤维组分可以由合成材料制成，如聚酰胺、聚烯烃、聚丙烯腈、聚酯； 由天然材料制成，如纤维素；或者由半合成材料制成，如纤维素酯。
[0039] 在本文中可交换使用的术语"活化炭"或"活性炭"指已进行加工以增加其孔结构 的含碳物质。活性炭是具有非常高表面积的多孔固体。它们可以源自各种来源，包括煤炭、 木材、椰壳、果壳和泥炭。可以利用在受控气氛下物理活化（包括加热）或者利用强酸、碱 或氧化剂化学活化来从这些材料制备活性炭。活化过程产生具有高表面积的多孔结构，这 赋予活性炭高的杂质去除能力。可以修改活化过程以控制表面的酸性。
[0040] 典型的活化过程包括使碳源如树脂废物、煤炭、煤焦、石油焦、褐煤、聚合材料、以 及包括纸浆和纸的木质纤维素材料、来自纸浆生产的残余物、木材（如木肩、锯末和木粉）、 坚果壳（如杏仁壳和椰子壳）、果仁以及果核（如橄榄核和樱桃核）进行热过程（例如，用 氧化性气体）或化学过程（例如，用磷酸或金属盐，如氯化锌）。包括用磷酸（H 3PO4)化学 活化基于木材的碳的示例性