过程公开于美国专利第Re. 31，093号，其使得碳的脱色和气体 吸附能力的提高。而且，美国专利第5, 162, 286号教导了基于木材的材料的磷酸活化，所述 基于木材的材料特别致密且包含相对高（30%)的木质素含量，如坚果壳、果核和果仁。木 质纤维素材料的磷酸活化还在美国专利第5, 204, 310号中讨论，作为制备高活性和高密度 的碳的一个步骤。这段中列出的每个专利的教导整体援引加入本文。
[0041]与大多数其他吸附材料相反，认为活性炭利用相对弱的范德华力或伦敦分散力与 分子相互作用。如通过基于氮吸附的Brunauer-Emmett-Teller ( "BET"）方法（本领域公 知的方法）测量的，典型的商业活性炭产品表现出至少300m2/g的表面积。
[0042] 虽然活化碳或活性碳以前已用于纯化液体和气体以及通过结合杂质来从其他杂 质纯化重组表达的抗体的方法，但是其以前尚未用于通过采用基于待选择性地去除的蛋白 的特性的溶液条件来从两种或更多种蛋白的混合物选择性地去除蛋白。结果，通过从两种 或更多种蛋白的混合物选择性地去除蛋白，未去除的蛋白的纯度增加。
[0043] 在一些实施方案中，两种或更多种蛋白的混合物包括至少一种待选择性地去除的 蛋白以及待利用本文所述方法纯化的另一种蛋白。一般来说，选择性地去除其他蛋白之后， 选择性地去除混合物中的一种或多种其他蛋白之后保留的蛋白的纯度增加。纯度增加的蛋 白称作靶蛋白。靶蛋白可以是免疫球蛋白或非免疫球蛋白。在一些实施方案中，靶蛋白为 免疫球蛋白，例如单克隆抗体。
[0044] 以下是可以根据本发明纯化的蛋白的实例。如上文讨论的，在一些实施方案中， 靶蛋白为单克隆抗体。靶蛋白的其他实例包括重组蛋白，其包括但不限于重组人生长激 素、重组人胰岛素、重组促卵泡激素、重组因子VII (抗血友病因子）、重组人促红细胞生 成素、重组粒细胞集落刺激因子、重组α -半乳糖苷酶a、重组艾杜糖苷酸酶、重组加硫酶 (galsulfase)、重组链道酶α、重组组织纤溶酶原激活物、重组人干扰素、重组胰岛素样生 长因子1以及重组天冬酰胺酶。
[0045] 在本发明的其他实施方案中，靶蛋白是源自人血液或其他生理流体的蛋白。这类 蛋白的实例包括但不限于免疫球蛋白G和M、VIII因子、IX因子、抗凝血酶III以及a-I-抗 膜蛋白酶。
[0046] 术语"免疫球蛋白"、"Ig"或"IgG"或"抗体"（在本文中可交换使用）指具有由两 条重链和两条轻链组成的基本4多肽链结构的蛋白，例如通过链间二硫键稳定所述链，其 具有特异性结合抗原的能力。术语"单链免疫球蛋白"或"单链抗体"（在本文中可交换使 用）指具有由一条重链和一条轻链组成的基本2-多肽链结构的蛋白，例如通过链间肽接头 稳定所述链，其具有特异性结合抗原的能力。术语"结构域"指包含例如通过折叠和/ 或链内二硫键稳定的肽环（例如，包含3-4个肽环）的重链或轻链多肽的球状区域。基于 在"恒定"结构域的情况下在各种类别成员的结构域内相对缺少序列变化，或者在"可变"结 构域的情况下在各种类别成员的结构域内的显著变化，结构域在本文中进一步称为"恒定" 或"可变"的。抗体或多肽"结构域"在本领域中常可交换地称作抗体或多肽"区"。抗体轻 链的"恒定"结构域可交换地称为"轻链恒定区"、"轻链恒定结构域"、"CL"区或"CL"结构 域。抗体重链的"恒定"结构域可交换地称为"重链恒定区"、"重链恒定结构域"、"CH"区或 "CH"结构域。抗体轻链的"可变"结构域可交换地称为"轻链可变区"、"轻链可变结构域"、 "VL"区或"VL"结构域。抗体重链的"可变"结构域可交换地称为"重链可变区"、"重链可 变结构域"、"VH"区或"VH"结构域。
[0047] 免疫球蛋白或抗体可以是单克隆或多克隆的，并且可以以单体或聚合物形式存 在，例如以五聚体形式存在的IgM抗体和/或以单体、二聚体或多聚体形式存在的IgA抗 体。免疫球蛋白或抗体还可以包括多特异性抗体（例如，双特异性抗体）。
[0048] 术语"Fc区"和"包含Fc区的蛋白"表示所述蛋白包含免疫球蛋白的重链和/或 轻链恒定区或结构域（如先前定义的CH和CL区）。包含"Fc区"的蛋白可以具有免疫球 蛋白恒定结构域的效应子功能。"Fc区"如CH 2/CH3区可以选择性地结合至亲和配体如A蛋 白或其功能变体。在一些实施方案中，包含Fc区的蛋白特异性地结合A蛋白或者其功能衍 生物、变体或片段。在其他实施方案中，包含Fc区的蛋白特异性地结合G蛋白或L蛋白，或 者它们的功能衍生物、变体或片段。
[0049] 如上文讨论的，在一些实施方案中，靶蛋白为包含Fc区的蛋白，例如，免疫球蛋 白。在一些实施方案中，包含Fc区的蛋白为重组蛋白，其包括融合至另一多肽或其片段的 免疫球蛋白的Fc区。
[0050] 一般来说，免疫球蛋白或抗体针对所关注的"抗原"。优选地，抗原是生物学上重要 的多肽，并且向患有疾病或病症的哺乳动物给药抗体可以在该哺乳动物中导致治疗益处。
[0051] 在本文中可交换使用的术语"单克隆抗体"或"MAb"指获得自一群基本上均质 的抗体的抗体，即该群中的各个抗体除了少量可能天然存在的突变之外是相同的。单 克隆抗体是高度特异性的，针对单个抗原位点。此外，与通常包括针对不同决定簇（表 位）的不同抗体的常规（多克隆）抗体制品相反，每种单克隆抗体针对抗原上的单一决 定簇。修饰语"单克隆"表示抗体的特征为获得自基本上同质的抗体群体，并且不应当理 解为要求通过任何特定方法制备抗体。例如，根据本发明使用的单克隆抗体可以通过由 Kohler et al. ,Nature 256:495(1975)首先描述的杂交瘤方法制备，或者可以通过重组 DNA方法制备（参见例如，美国专利第4, 816,567号）。"单克隆抗体"还可以分离自噬菌 体抗体文库，使 Clackson et al. ,Nature 352:624-628(1991)和 Marks et al.，J.Mol. Biol. 222:581-597(1991)所述的技术。
[0052] 单克隆抗体还可以包括"嵌合"抗体（免疫球蛋白），其中部分重链和/或轻链 与源自特定物种的抗体或者属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或者同源， 而链的剩余部分与源自另一物种的抗体或者属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序 列相同或者同源；以及这类抗体的片段，只要它们表现出期望的生物学活性（美国专利第 4, 816, 567 号；和 Morrison et al·，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855(1984))。
[0053] 在本文中使用时，术语"高变区"指负责抗原结合的抗体的氨基酸残基。高变区 包含来自"互补决定区"或"⑶R"的氨基酸残基（即轻链可变结构域中的残基24-34 (LI)、 50-56 (L2)和 89-97 (L3)以及重链可变结构域中的 31-35 (HI)、50-65(H2)和 95-102 (H3); Kabat et al. , Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed.Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，Md. (1991))和 / 或来自"高 变环"的那些残基（即轻链可变结构域中的残基26-32(Ll)、50-52(L2)和91-96(L3)以 及重链可变结构域中的 26-32(Η1)、53-55(Η2)和 96-101(H3) ;Chothia and Lesk J.Mol. Biol. 196:901-917(1987))。"框架"或"FR"残基是除如本文所定义的高变区残基以外的那 些可变结构域残基。
[0054] 非人（例如，小鼠）抗体的"人源化"形式为嵌合抗体，其包含源自非人免疫球蛋白 的最小序列。人源化抗体的大部分是人免疫球蛋白（受体抗体），其中受体的高变区残基被 具有期望的特异性、亲和性和能力（capacity)的非人物种（供体抗体）如小鼠、大鼠、兔或 非人灵长类的高变区残基代替。在某些情况下，人免疫球蛋白的Fv构架区（FR)残基被相应 的非人残基代替。此外，人源化抗体可以包含在受体抗体或供体抗体中未发现的残基。进行 这些修饰以进一步精制抗体的性能。一般来说，人源化抗体包含基本上所有的至少一个、通 常两个可变结构域，其中所有或基本上所有高变环对应于非人免疫球蛋白的那些高变环， 并且所有或基本上所有FR区是人免疫球蛋白序列的那些FR区。人源化抗体可以包含至少 一部分免疫球蛋白恒定区（Fe)，通常为人免疫球蛋白的恒定区。进一步的细节参见Jones et al.，Nature321:522-525 (1986) ;Riechmann et al·，Nature 332:323-329(1988);和 Presta，Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)〇
[0055] 在本文中可交换使用的术语"多核苷酸"和"核酸分子"指任何长度的核苷酸的 聚合物形式，核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸。这些术语包括单链、双链或三链DNA，基因组 DNA，cDNA，RNA，DNA-RNA杂合物，或者包含嘌呤和嘧啶碱基的聚合物，或者其他天然、化学 或生物化学修饰的、非天然或衍生化的核苷酸碱基。多核苷酸骨架可以包含糖和磷酸基 团（通常可以在RNA或DNA中找到），或者修饰或取代的糖或磷酸基团。此外，双链多核苷 酸可以通过合成互补链并在适当的条件下退火链，或者通过利用DNA聚合酶用适当的引物 从头合成互补链来获得自化学合成的单链多核苷酸产物。核酸分子可以采用许多不同形 式，例如，基因或基因片段、一个或多个外显子、一个或多个内含子、mRNA、cDNA、重组多核苷 酸、支化的多核苷酸、质粒、载体、分离的任何序列的DNA、分离的任何序列的RNA、核酸探针 以及引物。多核苷酸可以包含修饰的核苷酸，如甲基化的核苷酸和核苷酸类似物、尿嘧啶 (uracyl)、其他糖和连接基团如氟代核糖（fluororibose)和硫代、以及核苷酸分支。如本 文所用，"DNA"或"核苷酸序列"不仅包括碱基A、T、C和G，而且还包括任何它们的类似物或 这些碱基的修饰形式，如甲基化的核苷酸，核苷酸间修饰如不带电荷的连接和硫酸、使用糖 类似物、以及修饰和/或可选的骨架结构，如聚酰胺。
[0056] 如本文所用，术语"溶液"、"组合物"或"样品"指两种或更多种蛋白的混合物，其 中一种蛋白为待纯化的靶蛋白或所关注的蛋白，而其他一种或多种蛋白是不期望的，并且 利用本文所述的方法选择性地去除。在一些实施方案中，样品包含细胞培养物进料，例如包 含两种或更多种蛋白的来自哺乳动物细胞培养物（例如，CHO细胞）的进料。但是，样品还 涵盖用于产生所关注的蛋白或靶蛋白的非哺乳动物表达系统。
[0057] 如本文所用，术语"非哺乳动物表达系统"指用来产生治疗性蛋白的所有宿主细 胞或生物体，其中所述宿主细胞或生物体是非人来源的。用于产生所关注的蛋白或靶蛋白 的非哺乳动物表达系统的实例包括酵母如酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)和毕赤 酵母（Pichia pastoris)，细菌如大肠杆菌（Escherichia coli)、巨大芽抱杆菌（Bacillus megaterium)、桥石短芽孢杆菌（Brevibacillus choshinensis)，昆虫细胞如草地夜蛾 (Spodoptera frugiperda)细胞、杆状病毒感染的昆虫细胞，以及藻类细胞。
[0058] 如本文所用，术语"多肽"一般指具有超过约10个氨基酸的肽和蛋白。在本文中 可交换使用的术语"所关注的蛋白"和"靶蛋白"指蛋白或多肽，通过选择性地去除混合物 中的其他蛋白或多肽来将其从两种或更多种蛋白或多肽的混合物纯化。
[0059] 在本文中可交换使用的术语"纯化"、"增加纯度"、"分离（separating) "或"分离 (isolating)"指通过利用本文所述的方法从混合物选择性地去除一种或多种其他蛋白来 增加混合物中靶蛋白比一种或多种其他蛋白的比例。通常，去除包含靶蛋白的样品中存在 的一种或多种其他蛋白之后，靶蛋白的纯度增加50 %、或60 %、或70 %、或80 %、或90 %或 更多。
[0060] 在本文中可交换使用的术语"选择性地去除"和"选择性的去除"指通过在pH条 件下将混合物暴露于含碳物质（例如，活性炭）来从两种或更多种蛋白的混合物去除蛋白， 所述PH条件在去除的蛋白的等电点的约2. OpH单位内。因此，在本文所述的各种实施方案 中，在接近期望去除的蛋白的等电点的PH条件下将活性炭添加至两种或更多种蛋白的混 合物，由此活性炭结合至所述蛋白。随后从混合物去除活性炭，由此去除结合的蛋白。
[0061] 在本文中可交换使用的术语"流过方法"、"流过模式"和"流过色谱"指一种产物 分离技术，其中样品中的至少一种产物意图流过含碳介质，而至少一种潜在组分结合至所 述含碳介质（例如，活性炭）。
[0062] 意图流过的样品一般称作"流动相"。"流过模式"一般为等度分离（即，期间流动 相的组成未改变的过程）。用于流过的介质通常用包含靶蛋白分子的相同缓冲液溶液预平 衡。纯化之后，可以用额外量的相同缓冲液冲洗介质以增加产物回收率。
[0063] 术语"缓冲液"指通过其酸-碱缀合组分的作用抗pH变化的溶液。可以用于本文所 述方法的各种缓冲液描述于Buffers. A Guide for the Preparation and Use of Buffers in Biological Systems, Gueffroy, D. , ed. Calbiochem Corporation (1975) 〇 不同缓冲液 维持不同范围的pH，例如磷酸盐缓冲液通常用于6. 0-8. 0的pH，而对于更高的pH，可以所用 硼酸盐缓冲液，对于更低的PH，可以使用碳酸盐缓冲液。本领域技术人员能够根据待维持的 pH容易地确定使用的合适缓冲液。可以用于本发明的方法的缓冲液的非限制性实例包括 MES、M0PS、M0PS0、Tris、HEPES、磷酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、琥珀酸盐、碳酸盐、硼酸盐和铵缓 冲液，以及这些物质的组合。
[0064] 术语"洗涤缓冲液"或"平衡缓冲液"在本文中可交换使用，指在使蛋白的混合物 与含碳物质接触之前用来洗涤或重新平衡含碳物质的缓冲液。
[0065] 术语"电导率"指水溶液在两个电极之间传导电流的能力。在溶液中，电流通过离 子转运流动。因此，随着水溶液中存在的离子量的增加，溶液会具有较高的电导率。测量电 导率的单位为milliSiemens每厘米（mS/cm或mS)，并且可以利用可商购的电导率计（例 如，由Orion销售）进行测量。溶液的电导率可以通过改变其中离子的浓度来改变。例如， 可以改变溶液中缓冲剂的浓度和/或盐（例如NaCl或KC1)的