核苷激酶旁路组合物和方法
【专利说明】
[0001] 优先权要求 本申请要求2012年12月6日提交的美国临时申请号61/734, 049和2013年3月15 日提交的美国临时申请号61/787, 377的优先权。
技术领域
[0002] 本发明涉及易于被还原剂(诸如谷胱甘肽）生物活化的、二硫化物掩蔽的前药化合 物、组合物和方法。这样的基于二硫化物的化合物、组合物和方法可以用于例如提供用作治 疗剂的新前药。
【背景技术】
[0003] 下面是关于某些前药组合物的相关技术的讨论。所述讨论仅仅为了理解下面的发 明而提供。该概要并非承认下面描述的任何工作是要求保护的发明的现有技术。
[0004] 药物化学和生物技术领域已经产生了许多具有充分证实的体外活性的生物活性 化合物。但是，需要将这些化合物有效地递送至感兴趣的靶细胞和组织，以便用作研宄工具 或体内治疗剂。许多生物活性分子具有由于它们的净负（阴离子）电荷、它们的大小或阴 离子电荷和大小二者的组合而受损的体内活性谱。在克服这些屏障的尝试中，已经开发了 多种策略。在寡核苷酸递送的情况下，病毒的和非病毒的递送策略已经产生了混合的结果， 其中大多数具有剂量限制毒性或其它安全性问题。这样的安全性问题是给感兴趣的细胞和 组织有效地递送其它带电荷的分子所面临的挑战的代表。这些挑战已经驱动前药的差异方 案中的创新。
[0005] 前药是以无活性形式或显著更少活性形式施用的药理学物质。一旦施用，前药在 被称作生物活化的过程中在体内代谢成活性代谢物。在前药应用背后的基本原理通常是关 于吸收、分布、代谢和排泄（ADME)优化。阴离子掩蔽前药代表一个新的化合物平台，其会提 供通过多种机制改善ADME性能的优点。首先，阴离子掩蔽前药会中和阴离子电荷，且因此 克服细胞吸附和组织分布的屏障。其次，因为某些核酸酶依赖于阴离子电荷来鉴别它们的 底物，所以阴离子掩蔽前药可以绕过代谢。此外，前药的电荷掩蔽基团还可以充当多种化学 实体的支架，所述化学实体可以赋予改善的靶向、免疫抑制或可溶性谱。所有这些因素可以 导致感兴趣的化合物或分子的改善的药代动力学和药效动力学性能。
[0006] 已经公开了阴离子掩蔽磷酸三酯保护基的例子，参见例如Lebleu等人，（2000)， Russ. J. Bioorg. Chem.，26，174-182。但是，该方案利用紫外福射进行去保护，因而不 适合体内应用。Beaucage藥Λ「2007)，J Crg泛￡麗，72，805-815描述了某些磷酸 三酯寡核苷酸前药的体片生物活化。但是，该方案产生THF作为生物转化后的副产物。WO 2010/039543描述了某些阴离子掩蔽二硫化物磷酸三酯寡核苷酸前药。尽管如此，这些二硫 化物前药的环脱酯化会导致反应性的硫杂丙环物质的释放，这可以由于剂量限制毒性而限 制这样的前药的应用。
[0007] 谷胱甘肽（GSH)是含有半胱氨酸(其通过正常肽键连接至甘氨酸)的胺基和谷氨酸 盐侧链的羧基之间的不寻常肽键的三肽。谷胱甘肽是一种重要的抗氧化剂，会阻止由活性 氧诸如自由基和过氧化物造成的对细胞组分的损伤。谷胱甘肽硫醇基团是还原剂，以大约 5 mM的浓度存在于细胞中。谷胱甘肽通过充当电子供体而将在细胞质蛋白内形成的二硫键 还原为半胱氨酸。在该过程中，谷胱甘肽转化成它的氧化形式谷胱甘肽二硫化物（GSSG)，它 也被称为L (-)-谷胱甘肽。谷胱甘肽一旦被氧化，使用NADPH作为电子供体，通过谷胱甘肽 还原酶可以将所述谷胱甘肽还原回去。因此，谷胱甘肽是前药的有吸引力的生物转化还原 剂。
[0008] 谷胱甘肽活化的前药的某些例子公开在，例如，Gunnarsdottir等人，（2003)， Drug Metabolism and Disposition, 32，321-327和Tirouvanziam等人，（2006)，PNAS， 103，12，4628-4633。但是，这些谷胱甘肽活化的前药不会提供任何阴离子电荷掩蔽能力。 因此，需要易于在体内生物转化的改善的阴离子掩蔽前药。
【发明内容】
[0009] 本发明提供了关于提供谷胱甘肽活化的前药组合物和方法的问题的解决方案，所 述前药组合物和方法能够掩蔽阴离子电荷且不会导致生物转化后反应性物质的形成。
[0010] 本文中公开了前药化合物和组合物以及制备和使用它们的方法。本发明的前药化 合物、组合物和方法的特征在于用于掩蔽阴离子电荷的、构象上受限制的二硫化物磷酸三 酯基团。所述构象上受限制的二硫化物磷酸三酯基团还可以充当用于连接辅助分子(诸如 靶向基团、免疫抑制基团、可溶性增强基团等)的支架。在生物转化过程中，所述构象上受限 制的二硫化物磷酸三酯基团会经由谷胱甘肽介导的还原/生物转化而经历电荷耗散驱动 的环脱酯化，以释放有活性的感兴趣的阴离子分子和排出任何辅助基团。在生物转化过程 中，反应性的硫杂丙环物质经由分子内l，5-e X〇-tet环闭合而在内部被淬灭以产生稳定的 四氢噻吩类化合物。本发明的二硫化物磷酸三酯基团可以提供本领域已知的核酸、多核苷 酸、寡核苷酸、肽、多肽、蛋白、抗体、激素、小分子、抗病毒剂和其它生物活性的分子的电荷 掩蔽的前药类似物。
【附图说明】
[0011] 图1显示了提议的机制的一个非限制性实施例，所述机制包含本发明的二硫化物 掩蔽的前药的非酶促的、化学驱动的释放。尽管不希望受理论约束，该机制包括：（1) pH-依 赖性的二硫化物还原，随后是（2)电荷-耗散驱动的环脱酯化，随后是（3)分子内硫杂丙环 重排。靶向基团（TG)可以是本领域普遍已知的任意靶向基团或部分（例如，配体、肽、抗体 等），且任选地存在。离去基团优选地是本领域普遍已知的五价磷离去基团，但是可以包括 本领域技术人员容易理解的其它合适的离去基团（例如，三氟甲基磺酸酯、氟磺酸酯、甲苯 磺酸醋、甲磺酸醋、carbonylates、硝酸醋、磷酸醋等）。净荷是优选地要施用给对象的化合 物，诸如本领域普遍已知的任何治疗或预防化合物，包括核酸、核苷酸、核苷、多核苷酸、寡 核苷酸、肽、多肽、蛋白、抗体、激素、小分子、抗病毒剂和其它生物活性的分子。
[0012] 图2显示了通过LCMS监测的、当在pH 7. 3和40 °C暴露于谷胱甘肽（50mM)时 单-酯从化合物16-1和16-2的释放。
【具体实施方式】
[0013] 术语和定义 如在本申请中使用的，适用以下术语和定义。
[0014] 在本说明书和所附权利要求中使用的单数形式"一个"、"一种"和"所述"包括复 数指示物，除非所述内容另外清楚地指示。因而，例如，对"一个细胞"的提及包括两个或更 多个细胞的组合等。
[0015] 任何浓度范围、百分比范围、比率范围或整数范围应当理解为包括在列举的范围 内的任意整数值，且当适当时，包括其分数（诸如整数的1/10和1/100)，除非另外指出。
[0016] 本文中关于数字使用的"约"或"大约"通常意图包括落在该数字的任一个方向 (大于或小于）的5%范围内的数字，除非另有说明或另外从上下文中显而易见（这样的数 字会超过可能值的100%的情况除外）。在阐述范围的情况下，在该范围内包括端点，除非另 有说明或另外从上下文中显而易见。
[0017] 本文中使用的术语"烃基（alkyl)"表示本领域中普遍接受的它的含义。该术语通 常表示饱和或不饱和烃，包括直链、支链、烯基、炔基和环状基团，但是不包括芳族基团。尽 管如此，烃基也表示非芳族杂环基团。优选地，烃基具有1-12个碳。更优选地，它是1-4个 碳的低级烃基，更优选1-4个碳。烃基可以是被取代的或未被取代的。当被取代时，取代基 团（一个或多个）优选地是羟基、卤素、氰基、C1-C4烷氧基、=0、=S、N0 2、SH、順2或NR iR2，其 中札和R 2独立地是H或C1-C4烷基。
[0018] 本文中使用的术语"芳基"表示本领域中普遍接受的它的含义。该术语通常表示 具有至少一个含共轭 π电子系统的环的芳族基团，且包括碳环芳基、杂环芳基和联芳基， 所有这些可以被任选地取代。芳基的优选取代基(一个或多个)是卤素、三卤甲基、羟基、SH、 0Η、氰基、C1-C4烷氧基、C1-C4烷基、C2-C4烯基、C2-C4炔基、順 2和NR J2基团，其中R兩 馬独立地是H或C1-C4烷基。
[0019] 本文中使用的术语"烃基芳基"表示本领域中普遍接受的它的含义。该术语通常 表示与芳基(如上所述)共价连接的烃基(如上所述)。碳环芳基是其中芳族环上的环原子都 是碳原子的基团。碳原子是任选取代的。杂环芳基是在芳族环中具有1-3个杂原子作为环 原子且剩余环原子是碳原子的基团。合适的杂原子包括氧、硫和氮，且具有此类杂原子的杂 环芳基的例子包括呋喃基、噻吩基、吡啶基、吡咯基、N-低级烷基吡咯并、嘧啶基、吡嗪基、咪 唑基等，全部任选地取代。优选地，烃基是C1-C4烷基。
[0020] 本文中使用的术语"酰胺"表示本领域中普遍接受的它的含义。该术语通常表 示-C (0) -NH-R，其中R是烃基、芳基、烃基芳基或氢。
[0021] 本文中使用的短语"生物系统"表示本领域中普遍接受的它的含义。该术语通常表 示得自生物学来源的纯化或未纯化形式的材料，所述生物学来源包括、但不限于人或动物， 其中所述系统包括RNAi活性所需的组分。因此，该短语包括例如，细胞、组织、对象或生物 体、或其提取物。该术语还包括重构的得自生物学来源的材料。
[0022] 本文中使用的术语"细胞"表示本领域中普遍接受的它的含义。参考本发明的示 例性核酸分子，该术语以其通常的生物学含义使用，并且不表示完整多细胞生物，例如具体 地不表示人类。细胞可以存在于生物体内，例如禽类、植物和哺乳动物，例如人类、奶牛、羊、 猿、猴、猪、狗和猫。细胞可以是原核的(例如，细菌细胞)或真核的(例如，哺乳动物或植物细 胞)。细胞可以具有体细胞或种系起源，是全能的或多能的，在分裂中或非分裂中。细胞还 可以衍生自或可以包含配子或胚胎、干细胞、或完全分化的细胞。
[0023] 本文中使用的术语"组合物"或"制剂"表示在本领域中普遍接受的它们的含义。 这些术语通常表示这样的组合物或制剂，诸如在药学上可接受的载体或稀释剂中：其呈适 合于施用（例如，全身或局部施用)进细胞或对象内的形式，所述对象包括例如人。合适的形 式部分地依赖于用途或进入途径，例如口服、透皮、吸入或通过注射。此类形式不应阻止组 合物或制剂到达靶细胞。例如，注射进血流中的组合物应当是可溶的。其它因素是本领域 已知的，且包括考虑因素诸如毒性和阻止组合物或制剂发挥其作用的形式。本文中使用的 药物制剂包括用于人和兽医学应用的制剂。
[0024] 本文中使用的术语"叶酸基团"表示本领域中普遍接受的它的含义。该术语通常 表示包含下述化学基团的基团：
[0025] 术语"包括"（及其任意形式，诸如"包含"和"含有"）、"包含"（及其任意形式，诸 如"具有"或"有"）或"含有"（及其任意形式，诸如"含"或"包含"）是包含性的和开放式 的，且不排除额外的、未列举的要素或方法步骤。
[0026] 术语"配体"表示本领域普遍已知的这样的化合物和组合物。在本文中（包括在 具体地通过引用并入本文的文件中）描述了这样的配体的非限制性例子。这样的配体的 非限制性例子描述在美国公开号US2008/0152661 Al和US 2004/0162260 Al (#>//， 〇0皿-1^六、〇01?^口-1^六、〇01?^6、〇0厘-隱6等）和美国专利申请号 10/427，160 10/201，394、 61/322,422、61/378,609 和 61/315,223 以及美国专利号 6,528,631、6,335,434、 6, 235, 886、6, 153, 737、5, 214, 136 和 5, 138, 045 中。也参见 Manoharan, ANTISENSE & NUCLEIC ACID DRUG DEVELOPMENT 12:103-128 (2002)。本发明的前药分子可以与如本文 中所述的或本领域以其它方式已知的任何共价连接的配体一起配制或施用。
[0027] 本文中使用的术语"连接基"表示本领域普遍已知的它的含义。在本文中(例如在 表1中，且包括在具体地通过引用并入本文的文件中）描述了连接基的非限制性例子。
[0028] 表 1
本文中使用的术语"哺乳动物的"或"哺乳动物"表示本领域中普遍接受的它的含义。该 术语通常表示任何温血脊椎动物物种，诸如人、小鼠、大鼠、狗、猫、仓鼠、豚鼠、兔、家畜等。
[0029] 本文中使用的术语"N-乙酰基半乳糖胺基团"表示本领域中普遍接受的它的含义。 该术语通常表示包含下述化学基团的基团：
本文中使用的术语"核苷"表示本领域中普遍接受的它的含义，且包括本领域技术人员 普遍已知的其核苷类似物或核碱基类似物。可能适用于本发明的前药应用的基于核苷的治 疗性化合物（和对应的适应症）的非限制性例子包括在下面表2中描述的那些，参见例如 Errasti-Murugarren 和 Pastor-Anglada (2010)，Pharmacogenomics, 11(6)，809-841〇
[0030] 表 2
[0031] 本文中使用的术语"肽基团"表示本领域中普遍接受的它的含义。该术语通常表 示具有一种或多种肽功能性的基团。
[0032] 术语"聚合物"表示本领域普遍已知的聚合的化合物、组合物和制剂。在本文中(包 括在具体地通过引用并入本文的文件中）描述了这样的聚合物(包括聚合的递送系统）的非 限制性例子。本发明的分子或化合物可以与如本文中所述的或本领域以其它方式已知的任 何聚合物一起配制或施用。
[0033] 本文中使用的术语"类固醇基团"表示本领域中普遍接受的它的含义。该术语通 常表示具有一种或多种类固醇功能性的基团，诸如胆固醇。
[0034] 本文中使用的术语"对象"表示本领域中普遍接受的它的含义。该术语通常表示 可以给其施用本发明的核酸分子的生物。对象可以是哺乳动物或哺乳动物细胞，包括人或 人细胞。该术语还表示这样的生物：其是外植细胞的供体或受体或所述细胞自身。
[0035] 本文中使用的短语"全身施用"表示本领域中普遍接受的它的含义。该短语通常 表示药物在血流中的体内全身性吸收或积累，随后遍及整个身体分布。
[0036] 本文中使用的术语"靶向试剂"表示本领域中普遍接受的它的含义。该术语通常 表示这样的基团：其给一个或多个细胞、组织或器官(诸如在对象或生物体中）赋予某种程 度的靶标特异性，并从而赋予用感兴趣的化合物或组合物靶向这样的细胞、组织或器官的 能力。
[0037] 本文中使用的短语"治疗有效量"表示本领域中普遍接受的它的含义。该术语通 常表示这样的化合物或组合物的量：其将在细胞、组织、系统、动物或人中引起研宄人员、兽 医、医生或其它临床医师寻求的生物学或医学应答。例如，如果给定的临床治疗被视作有效 的(此时至少存在与疾病或障碍有关的可测量参数的25%下降)，用于治疗该疾病或障碍的 药物的治疗有效量是实现该参数的至少25%下降所需的量。
[0038] 本文中使用的术语"维生素基团"表示本领域中普遍接受的它的含义。该术语通 常表示具有一种或多种维生素功能性的基团，诸如叶酸、维生素 C、维生素 E、维生素 D、维生 素 B5、维生素 B12等。
[0039] B.化合物 本文提供了具有式I的化合物：
其中， R1是H、0H、C η烷基、被一个或多个羟基取代的C η烷基、被一个或多个卤素基团取代 的CV6烷基、C η烯基、被一个或多个羟基取代的C η烯基、被一个或多个卤素基团取代的 CV6烯基、C η炔基、被一个或多个羟基取代的C η炔基、被一个或多个卤素基团取代的C η 炔基、(V6烷氧基、被一个或多个羟基取代的c η烷氧基、被一个或多个卤素基团取代的c η 烷氧基、芳基、杂芳基、杂环基、-NHCV6烷基、芳基C η烷基、杂芳基C η烷基、杂环基C η烷 基、胍基、Cp6烷基C (〇)〇-、芳基C (〇)〇-、杂环基C (〇)〇-、O-炔丙基、S-炔丙基、O-烯丙基、 S-烯丙基或X-L-Y ; 其中X是0、S、NH、C(O)、S(O)、Cp6烷基、被一个或多个羟基取代的C H烷基、被一个或 多个卤素基团取代的Cp6烷基、C η烯基、被一个或多个羟基取代的C η烯基、被一个或多个 卤素基团取代的Cp6烯基、C H炔基、被一个或多个羟基取代的C H炔基、被一个或多个卤素 基团取代的Cp6炔基、C H烷氧基、被一个或多