用于使用核苷酸缀合物的免疫测定的方法和设备的制造方法【专利说明】用于使用核苷酸缀合物的免疫测定的方法和设备[0001]本申请是申请日为2009年12月30日、申请号为200980153231.3、发明名称为"用于使用核苷酸缀合物的免疫测定的方法和设备"的发明专利申请的分案申请。[0002]引用参考相关申请[0003]本申请要求2008年12月31日提交的美国临时申请号61/142,048的优先权，将其通过引用以其全部并入本文。[0004]发明背景发明领域[0005]本发明涉及使用核苷酸缀合物进行各种用于确定分析物在样品中的存在的测定的方法和设备。[0006]背景信息的讨论[0007]-些低浓度靶分析物的检测对于一些疾病的早期诊断是重要的。例如，最近的研究暗示测量水平低于典型商业测定水平的心肌肌钙蛋白I(cTnl)为临床医生提供了有价值的信息。注意，甚至极低水平（即低于被认为指示急性心肌梗塞的水平）的cTnl可预示着将来不利的心血管状态。例如，Zethelius等人，（2006，"TroponinIasapredictorofCoronaryHeartDiseaseandMortalityin7〇-year-oldmen:Acommunity-basedcohortstudy",Circulation,第113卷：1071-1078)进行了研究以调查心脏Tnl浓度与未来冠状动脉心脏病的预测之间的关系。他们观察到在未显示心脏血管疾病的临床迹象但展现轻微升高的心脏Tnl水平的70岁老年男性中，可预测即将出现的冠状动脉心脏病事件。此外，Apple等人，（2008，"UseoftheCentaurTnl-UltraAssayforDetectionofMyocardialInfarctionandAdverseEventsinPatientsPresentingWithSymptomsSuggestiveofAcuteCoronarySyndrome'，,ClinicalChemistry,第54卷（4):723-728)在灵敏肌钙蛋白测定中进行了研究以评估基于检测极限处的cTnl值和第99个百分位参考值而评估短期不利事件的风险的预后价值。他们推断"我们的数据增加了日益增加的证据：使用改进的分析上强劲的、具有低LoD[检测的水平]的cTn测定，与低于测定的LoD的cTnl浓度相比，任何可测量的cTnl意味着更高的风险。"[0008]目前的即时护理（point-of-care)免疫测定技术，尽管其测量各种靶分析物的存在和浓度的能力是具有高度价值的，但其在可靠地检测极低水平的靶分析物例如cTnl的能力上比较有限。因此，存在对可靠地检测低水平靶分析物例如cTnl的需要，特别是在即时护理免疫测定分析物检测设备中。[0009]美国专利No.7,419,821(将其全部通过引用而并入本文）利用了夹心测定法，其中将两种捕获抗体固定在电极上并且用信号酶（例如碱性磷酸酶（ALP))标记两种信号抗体（例如FAB(片段抗原结合）抗体片段）以形成信号缀合物。分析物（例如抗原（例如cTnl))与捕获抗体和信号抗体结合以形成夹心测定，该测定提供了表示分析物存在的信号。常规地，通过交联技术使信号抗体与信号酶结合以形成信号缀合物。这些合成条件导致下列的宽泛范围：信号抗体与标记酶的比率，以及信号酶的数量/信号缀合物，和信号抗体的数量/缀合物。例如，对于FAB抗体片段，通常存在具有从无（O)FAB/信号缀合物-估计15个FAB/信号缀合物的信号缀合物统计群体。因此，通常通过尺寸排阻层析纯化合成的信号缀合物来产生具有更窄范围的信号抗体（例如FAB分子）/信号缀合物的信号缀合物群体。然而，此类纯化技术不合期望地导致减少的可预测性以及下列的可变比率：（i)信号抗体与信号酶（例如，FAB与ALP);(ii)信号酶与信号缀合物；和（iii)信号抗体与信号缀合物。这些可变比率限制了夹心测定可靠地检测样品中极低水平的靶分析物的能力。[0010]用于评估样品（包括体液和环境样品）中分析物（例如抗原分子）的浓度的基于酶联免疫吸附测定（ELISA)的测定通常需要将信号抗体共价地连接至信号酶以产生测定的检测组分的能力。该技术的历史和综述可见于Lequin(2005,EnzymeImmunoassay(EIA)/Enzyme-LinkedImmunosorbentAssay(ELISA),ClinicalChemistry,第51卷(12):2415-2418)中。存在对增加ELISA测定的灵敏度的需要，因为一些抗原以极低的浓度存在。[0011]美国专利No.5,164,311公开了通过将硫氢基添加至抗体以及将马来酰亚胺基添加至酶以产生经修饰的抗体和酶，并使经修饰的抗体与酶反应以产生缀合物来产生抗体-酶缀合物。如此，'311专利提出："提供下列标记系统将是有利的：其中直接抗体-酶缀合物可实现高的酶与抗体的比率，并从而提供接近或等于抗生物素蛋白-生物素标记系统的更高程度的灵敏度。此种改进的直接抗体-酶缀合物将不需要如生物素-抗生物素蛋白标记系统所需要的额外的温育步骤和洗涤步骤"。'311专利描述了对于酶-抗体缀合物使用含有具有交联硫氢基和马来酰亚胺基能力的交联分子的交联剂（例如SPDP)，然而在其用于合成寡核苷酸方面没有记载。[0012]已开发了用于DNA杂交技术（如Southern杂交）的分子生物学应用的、基于酶和合成寡核苷酸的缀合物的合成（Reyes&Cockerell,1993，"Preparationofpureoligonucleotide-alkalinephosphataseconjugates'，，NucleicAcidsResearch,vol21(23):5532-5533)。此类缀合物的所述应用没有预见其用于基于ELISA的测定。[0013]随着极灵敏的DNA扩增策略（例如美国专利No.5,656,493及其它文献所涉及的聚合酶链式反应（PCR))的发展，已认识到ELISA和PCR的组合可增加检测灵敏度。例如，Sano等人，（2000，''Immuno-PCR:verysensitiveantigendetectionbymeansofspecificantibody-DNAconjugates,Science,第258卷（5079):120-122)描述了该策略用于抗原检测的最早的应用之一。存在许多关于该方法的应用的参考文献，包括Kozlov等人，（2004，"EfficientstrategiesfortheconjugationofoligonucleotidestoAntibodiesEnablingHighlySensitiveProteinDetection'，，Biopolymers,第73卷：621-630)，他们描述了合成寡核苷酸抗体缀合合成策略以及此类特异性缀合物用于高灵敏度检测的应用。该方法与本发明不同，因为合成寡核苷酸被用于随后的DNA扩增，而这用作灵敏的检测方法。[0014]DNA扩增（例如PCR)的用途是有限的，因为其不允许将合成寡核苷酸-抗体缀合物用于现有的ELISA系统，并且其还需要利用要求专用设备的热循环能力。Adler在W02008/122310中描述了用于免疫测定的相关PCR法。许多相关策略已由Adler等人，（2008，"Sensitivitybycombination:immuno-PCRandrelatedtechnologies"，Analyst,第133卷：702-718);和Niemeyer等人，（2005，"Immuno_PCR:highsensitivitydetectionofproteinsbynucleicacidamplification"，TrendsinBiotechnology,第23卷（4):208-216)综述。[0015]Cantor和Chuck(美国专利5,635,602)描述了使用抗生物素蛋白/链霉抗生物素蛋白结合连接的双-蛋白质缀合物，他们教导将其用于免疫测定和PCR测定。例如，将第一抗体通过二硫键连接于DNA并且用生物素在另一端标记互补DNA。生物素可结合还结合生物素化的辣根过氧化物酶（HRP)的链霉抗生物素蛋白。所述HRP可与底物反应以产生化学发光信号。本公开内容不同，因为其不教导使用生物素-链霉抗生物素部分，相比于多价链霉抗生物素分子，所述生物素-链霉抗生物素部分不允许高度的控制。[0016]Tennila等人，（2008，"Peptide-oligonucleotideconjugatesformstableandselectivecomplexeswithAntibodyandDNA'，，BioconjugateChemistry,第19卷（7):1361-1367)描述了用于抗体表位定位的、缀合至合成寡核苷酸的短寡肽。他们在ELISA测定方面没有记载。[0017]Ketomaki&Lonnberg,2006，（"AMixed-PhaseImmunoassayBasedonSimultaneousBindingofFluorescentlyTaggedandPNA-ConjugatedpeptideEpitopesonAntibodies:QuantificationonPNA-CoatedMicroparticles,BioconjugateChemistry,第17卷：1063-68.)描述了其中有完整抗体(具有2个F(ab)结合部分）的系统，在所述抗体中，一个F(ab)结合部分结合具有荧光标签的肽，而另一个F(ab)结合部分结合具有核酸序列的肽（PNA)。PNA结合微粒上的互补PNA。这些作者未描述使用酶或抗体的共价连接，而是描述了使用抗体与结合微粒的分子的非共价结合。另一种非共价结合方法被用于产生信号的抗体。[0018]Wacker等人，（2004，"PerformanceofantibodymicroarraysfabricatedbyeitherDNA-directedimmobilization,directspotting,orstreptavidin-biotinattachment:acomparativestudy'，，AnalyticalBiochemistry,第330卷：281-287)描述了使用共价地连接至捕获抗体的合成寡核苷酸来产生抗体阵列，他们将其定义为DNA引导固定（DNA-directedImmobilization)(DDI)。合成寡核苷酸抗体缀合物的另一个应用是将捕获抗体固定至固体载体上（Jung等人，2008，"RecentAdvancesinimmobilizationmethodsofantibodiesonsolidsupports'Analyst,第133卷：697-701)。该应用与本方法的差异在于其未教导将抗体固定于固体载体。Lovrinovic等人，（2002,"Synthesisofprotein-nucleicconjugatesbyexpressedprotein1igation'，，ChemicalCommunications,issue7:822-823)公开了蛋白质-核酸缀合物，其中重组蛋白质是以利用DNA引导固定的蛋白质内含子（intein)序列设计的。蛋白质内含子为约150个氨基酸的多肽序列，其可"从伴有侧翼多肽（蛋白质外显子（extein))连接的初级翻译产物"中自我切除（Cook等人，1995，"PhotochemicallyInitiatedproteinsplicing"，AngewandteChemieInternationalEditioninEnglish,第34卷（15):1629-1630)。在该论文中，Lovrinovic使用了表达的蛋白质，该蛋白质包含具有共价连接的蛋白质内含子序列和之后的壳多糖结合结构域的重组蛋白质。首先在壳多糖柱上利用该壳多糖结合结构域纯化该多功能蛋白质杂合体分子。在纯化后向反应中加入包含与合成寡核苷酸序列共价连接的化学合成的半胱氨酸肽的其它分子，在通过转酯作用切除蛋白质内含子区域并接着连接化学连接的半胱氨酸-合成寡核苷酸杂合体后，所述其它分子被连接至重组蛋白的羧基末端。这现在产生了具有共价连接至半胱氨酸-合成寡核苷酸杂合体的、不含有蛋白质内含子序列的重组蛋白的分子。然后可将该新型分子用于将抗原（所述重组蛋白质）结合至与固体载体结合的互补的合成寡核苷酸，与DDI技术非常相似而在本申请中是用抗原或重组蛋白质分子替代了抗体。[0019]Fan等人，2008("IntegratedBarcodechipsforrapid,multiplexedanalysisofproteininmicroliterquantitiesofblood'，，NatureBiotechnology,AdvanceOnlinePublication)描述了该DDI技术的另一种变型。[0020]Heyduk等人，（2008，"MolecularPincers:Antibody-BasedHomogeneousProteinSensors",AnalyticalChemistry,第80卷：5152-5159)描述了基于焚光共振能量转移（FRET)的抗体检测技术，其中一个抗体分子具有缔合的第一合成寡核苷酸（所述寡核苷酸具有供体发色团），而第二抗体分子在抗原上的另一个位置上结合相同的抗原并且具有缔合的第二合成寡核苷酸（该寡核苷酸与第一合成寡核苷酸序列互补并具有受体发色团）。抗原上两个抗体的紧密靠近允许合成寡核苷酸序列杂交，从而使供体和受体发色团彼此紧密靠近，这减少了所产生的荧光。这是均相抗原检测法并且不采用捕获抗体。[0021]Niemeyer等人，（2002，"DNA-directedAssemblyofBienzymiccomplexesfromInVivoBiotinylatedNAD(P)H:FMNOxidoreductaseandLuciferase'，，（ChemBioChem，No02-03:242-245)描述了使用DNA引导的组织的空间有序的多酶复合物（MEC)，但在ELISA和更灵敏的免疫测定测试的发展方面没有记载。[0022]Seeman,(1999,"DNAengineeringanditsapplicationtonanotechnology"，TIBTECH,第17卷：437-443)描述了DNA支架的应用，其中互补的合成寡核苷酸序列可被设计为用于产生独特的结构，但在ELISA测定方面没有记载。[0023]Niemeyer,(2000,αSelf-assemblednanostructuresbasedonDNA:towardsthedevelopmentofnanobiotechnology",CurrentOpinioninChemicalBiology,第4卷：609-618)描述了应用DNA产生用于有序结构的支架骨架，但在ELISA和其它更灵敏的免疫测定方面没有记载。[0024]Storhoff&Mirkin,(1999,"ProgrammedmaterialssynthesiswithDNA"，（ChemicalReview,第99卷：1849-1862)描述了使用DNA作为支架材料，但在其对于ELISA测定的用途方面没有记载。[0025]Niemeyer等人，（1998，"CovalentDNA-StreptavidinConjugatesasBuildingBlocksfornovelBiometallicNanostructures^,Angew.Chem.Int.Ed.,第37卷(16):2265-2268)描述了使用DNA支架以产生具有多-链霉抗生物素蛋白分子聚集体的有结构的分子，其中使用连接至生物金属聚集体（biometallicaggregate)的该聚集体的生物素链霉抗生物素蛋白免疫球蛋白。[0026]Tomkins等人,(2001,"PreparationofSymmetricalandUnsymmetricalDNA-ProteinConjugateswithDNAasamolecularScaffold"，ChemBioChem,Issue5:375-378)描述了产生链霉抗生物素-DNA缀合物，关于链霉抗生物素蛋白-DNA哑铃通过原子力显微镜检查使其成像。该参考文献在ELISA和其它灵敏的免疫测定方面没有记载。[0027]Takeda等人，（2008，"Covalentsplitproteinfragment-DNAhybridsgeneratedthroughN-terminusspecificmodificationofproteinsbyoligonucleotides'，,OrganicandBiomolecularChemistry,第6卷：2187-2194)描述了使用连接至脱落蛋白的DNA杂合体来形成活性酶分子，但未预见ELISA或其它灵敏的免疫测定。[0028]Niemeyer等人，（1994，"Oligonucleotide-directedself-assemblyofproteins:semi-syntheticDNA-streptavidinhybridmoleculesasconnectorsforthegenerationofmacroscopicarraysandtheconstructionofsupramolecularbioconjugates",NucleicAcidsResearch,第22卷（25):5530-5539)描述了使用生物素化的抗体和生物素化的碱性磷酸酶以及与两个DNA序列连接的链霉抗生物素蛋白产生的抗体与ALP酶之间的杂合体，其中所述两个蛋白质通过生物素-链霉抗生物素结合而彼此结合。本发明描述了使用结合生物素化的抗体和碱性磷酸酶分子的末端链霉抗生物素蛋白分子、直接通过DNA杂交而构架在一起的两个分子。因为末端结合部分是链霉抗生物素蛋白，其不提供如对于共价结合的合成寡核苷酸序列将发现的受控合成的水平，因为例如，多价链霉抗生物素蛋白分子可结合被生物素化的抗体或碱性磷酸酶分子。[0029]Duckworth等人，（2007，"AUniversalMethodforthe当前第1页1 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