一种酶联免疫检测禽鹦鹉热衣原体的试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及检测试剂盒，具体地说，涉及酶联免疫检测禽鹦鹉热衣原体的试剂盒。
【背景技术】
[0002] 禽衣原体病(Avian Chlamydiosis)是由婴鸟鹉热衣原体(Chlamydia psittaci，Cp) 引起的一类家禽、鸟类及哺乳动物等人畜共患传染性疾病。常常表现为禽类呼吸道和消化 道疾病症状，感染家禽嗜睡、发烧、体重下降、鼻腔和眼睛异样分泌物、气囊炎、腹膜炎、心包 炎、肝周炎以及产蛋禽产蛋量下降，病死率可达30%;观赏鸟类感染后表现为食欲减退、体 重减轻、腹泻、黄色粪便、窦炎、呼吸道炎症以及肝脾肿大、气囊炎、心包炎、腹膜炎等症状。 该病偶尔也会感染牛、羊和其它哺乳动物，引起动物生殖道炎性病变、孕畜流产等症状。人 类在自然条件下可感染该病，主要引起呼吸道感染、肺炎和菌血症，所以临床上又称之为鹦 鹉热(psittacosis)或鸟疫(Ornithosis)。
[0003][0004] 目前国内外对鹦鹉热衣原体的主要检测手段包括两大类即抗原检测和血清学检 测。抗原检测方法有直接染色，免疫组织化学染色，病原分离和鉴定，免疫荧光技术，聚合酶 链反应，双抗夹心酶联免疫吸附试验。血清学检测方法有补体结合试验，间接血凝试验，胶 体金试纸条法等。
[0005] 直接染色病原法方法操作简单、检测快，但是灵敏性和特异性一般，结果判定需要 有丰富的专业技术经验，判定结果受主观影响较大，尤其辨认衣原体的EB和RB时候相当困 难。
[0006] 病原分离鉴定方法病原分离需要禽胚或细胞，分离过程比较复杂并对试验操作要 求较高一般基层试验室难以进行。免疫荧光抗体技术特异性强、敏感性高，是衣原体抗原鉴 定比较理想的方法，但荧光显微镜价格昂贵不适合作为常规检测方法。聚合酶链反应虽然 有较高的特异性和敏感性制备模板比较复杂所需样本量大，且需要PCR仪等贵重仪器，检测 试剂昂贵。
[0007] 双抗夹心酶联免疫吸附试验方法具有简便，灵敏，高效等特点但目前国内没有能 够检测禽衣原抗原的ELISA试剂盒。补体结合试验操作繁琐、敏感性低、检测时间长、需要较 高的专业知识，因此在临床应用中受到较多限制。
[0008]间接血凝试验方法操作程序简单、不需要特殊设备，但是结果判定受主观因素影 响较大，而且耦合抗原多为全菌体，可能与部分革兰氏阴性菌存在交叉反应，结果易产生假 阳性。胶体金试纸条法操作简单易行但检测敏感性较低。
[0009] 酶联免疫吸附试验是用于血清抗体检测的常用方法，若能选择并制备适宜的包被 抗原及通用性好的酶联二抗用于禽衣原体病ELISA抗体检测，则可达到通用性好、操作简 便、所需时间短、降低操作人员主观因素影响的目标，从而弥补上述对鹦鹉热衣原体检测方 法的不足。
【发明内容】
[0010] 为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种酶联免疫检测禽鹦鹉 热衣原体的试剂盒。
[0011] 为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：
[0012] 本发明提供一种酶联免疫检测禽鹦鹉热衣原体的试剂盒，所述试剂盒包括:包被 有鹦鹉热衣原体重组蛋白Μ0ΜΡ的固相载体，酶标抗体，禽鹦鹉热衣原体阴性对照血清，禽鹦 鹉热衣原体阳性对照血清;所述鹦鹉热衣原体重组蛋白Μ0ΜΡ的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1 所示。
[0013] 进一步地，所述固相载体包被鹦鹉热衣原体重组蛋白Μ0ΜΡ后，经抗原保护剂处理， 所述抗原保护剂含有2%的β-l，3/1，6葡聚糖，20%的甘油和0.01 %的明胶，余量为PBS。
[0014] 作为优选，本发明为了提供一种酶联免疫反应试剂盒，所述固相载体为采用酶标 板，如96孔酶标板。
[0015] 进一步地，本发明提供了包被有鹦鹉热衣原体重组蛋白Μ0ΜΡ的酶标板的制备方法 为：
[0016] 1)以鹦鹉热衣原体6BC株总DNA为模板，使用特异性引物M0MP-F和M0MP-R进行扩 增，得到1143bp的目的片段，核苷酸序列如SEQIDN0.2所示；
[0017] M0MP-F：AAAGAATTCTTGCCTGTAGGGAACCC；
[0018] M0MP-R：GGGGTCGACTTAGAATCTGAATTGAG；
[0019] 2)将扩增所得片段回收纯化后用EcoRlI和Sail双酶切回收纯化目的片段；
[0020] 3)将酶切好的目的片段与用相同酶切的PET28a( + )载体连接获得重组表达质粒； [0021] 4)将重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)内，37°C培养，IPTG诱导表达；
[0022] 5)将菌液离心收集沉淀，将沉淀重溶于适量体积的pH7.2的roS溶液中，经过超声 裂解处理后离心取沉淀；
[0023 ] 6)重复第5)步，获得的沉淀为重组蛋白包涵体；
[0024] 7)将步骤6)的沉淀经尿素溶解、透析复性后，与Ni-NTA琼脂糖凝胶混匀，低温结 合；
[0025] 8)将结合完毕后的蛋白与Ni-NTA琼脂糖混合物，倒入空Ni-NTA柱，以20mmol/L咪 唑溶液洗涤，除去杂蛋白；
[0026] 9)以250mmol/L的咪唑溶液洗脱Ni-NTA柱，收集经SDS-PAGE分析达到95%以上纯 化程度的重组蛋白Μ0ΜΡ洗脱液；
[0027] 10)将收集的蛋白洗脱液体装入透析袋中，在20倍体积的PBS溶液中透析去除咪 唑，冷冻抽干获得干粉重组蛋白Μ0ΜΡ;
[0028] 11)将重组蛋白干粉以pH9.6、50mM碳酸盐缓冲液稀释为终浓度0.5yg/mL，加入酶 标板各孔，4°C孵育16小时，用洗涤缓冲液PBST冲洗酶标板，再用封闭液(含5%脱脂奶粉的 PBST溶液)封闭，以封闭液200yL/孔封闭，37°C温育2小时，倒掉封闭液，PBST洗涤3次甩干以 封闭液200yL/孔封闭，37°C温育2小时，倒掉封闭液，PBST洗涤3次甩干以封闭液200yL/孔封 闭，37°C温育2小时，倒掉封闭液，PBST洗涤3次甩干倒掉封闭液，洗涤，甩干；
[0029] 12)封闭好的微孔板每孔加入200微升的抗原保护剂，37°C孵育4小时后，倒掉抗原 保护剂，洗涤，甩干，晾干，即获得包被有鹦鹉热衣原体重组蛋白Μ0ΜΡ的酶标板。
[0030] 进一步地，为了使检测试剂盒具有更好的通用性，所述酶标抗体为辣根过氧化物 酶标记的兔抗禽I gG。
[0031] 进一步地，本发明还提供了所述禽鹦鹉热衣原体阳性对照血清的制备方法，具体 如下：
[0032] 1)取鹦鹉热衣原体6BC株灭活抗原，将抗原以2SP溶液稀释至蛋白浓度为2mg/mL;
[0033] 2)选择8周龄，衣原体抗体为阴性SPF鸡，进行免疫；
[0034] 3)首免:将氟氏完全佐剂与衣原体抗原等量混合，充分乳化，取lmL颈部皮下多点 注射；
[0035] 4)二免:首免后第14天，取氟氏不完全佐剂与衣原体抗原等量混合，充分乳化，取 lmL颈部皮下多点注射；
[0036] 5)三免:二免后第7天，同二免方法加强免疫一次；
[0037] 6)四免:三免后第7天，肌肉和颈部皮下各注射衣原体抗原lmL;
[0038] 7)1周后采血，经衣原体IHA试剂盒测定血清抗体效价，选取效价2 1:256的SPF鸡， 进行心脏采血，无菌分离血清，水浴灭活，即获得禽鹦鹉热衣原体阳性对照血清。
[0039] 进一步地，所述禽鹦鹉热衣原体阴性对照血清的制备方法为：
[0040] 选取2~4只SPF鸡，优选2只，分别采血、分离血清，水浴灭活，经过衣原体间接血凝 (IHA)试剂盒检测，收集结果为阴性的禽血清，混合，即为禽鹦鹉热衣原体阴性对照血清。
[0041] 进一步地，所述试剂盒还包括洗涤缓冲液、酶标抗体稀释溶液、样本稀释缓冲液、 显色液和终止液。
[0042]其中，所述洗涤缓冲液为含0.5%。吐温-20、pH7.2的磷酸盐缓冲液(PBST);
[0043] 所述酶标抗体稀释溶液为含有1.0 %牛血清白蛋白、0.1 %。硫柳汞钠、5 %甘油、5 % 海藻糖的PH7.2的磷酸盐缓冲液；
[0044] 所述样本稀释缓冲液为含有1 %小牛血清、0.3%Triton-100、0.1%。硫柳汞钠的 pH7.2的磷酸盐缓冲液；
[0045]所述终止液为强酸，优选为蒸馏水配制的出504。
[0046] 进一步地，所述显色液包括显色剂A和显色剂B:显色剂A为含1.46 %磷酸氢二钠， 0.93 %柠檬酸，0.045 %过氧化氢的水溶液;显色剂B为含0.03 %四甲基联苯胺，0.096 %柠 檬酸，0.019%乙二胺四乙二酸钠盐，2%DMS0,4%甘油的水溶液。
[0047]本发明还提供了所述试剂盒的操作步骤：
[0048]用样本稀释液将阳性对照血清，阴性对照血清和样本以1:100倍稀释，以100μL7孔 加入到重组蛋白包被板内（其中阳性和阴性对照设复孔），37°C温育30min，倒掉反应