一种鸭疫里默氏菌感染鸭的酶联免疫检疫方法
【技术领域】
[0001]发明属于动物疾病诊断试剂领域，具体涉及一种鸭疫里默氏菌感染鸭的酶联免疫检疫方法。
【背景技术】
[0002]鸭疫里默氏菌(Riemerella anatipestifer，RA)是严重危害水禽养殖业的重要病原性细菌。由于RA的耐药性严重，其导致疾病的最佳防控策略是菌苗免疫预防。我国有关部门仅批准灭活菌苗可商品化用于水禽养殖。由于菌苗在生产中的应用，也导致了鸭疫里默氏菌感染鸭与灭活菌苗免疫鸭在检疫中难于区分。本发明公开一种鸭疫里默氏菌感染鸭的酶联免疫检疫方法，能区分鸭血清中特异性抗体是鸭疫里默氏菌感染后产生或免疫接种灭活菌苗后产生，也能用于鸭疫里默氏菌感染康复鸭的鉴别。
[0003]鸭是否感染鸭疫里默氏菌，可以用鸭疫里默氏菌分离鉴定、多聚酶链反应(PCR)技术、血清抗体检测等方法进行确证，但现有的相关方法均存在不同的缺点，不能作为检疫方法。
[0004](I)鸭疫里默氏菌的分离鉴定:可以确切诊断该细菌的临床感染，但存在操作复杂、耗时长、使用抗菌药物治疗的动物和康复期动物的假阴性率高，不适合于检疫等。
[0005](2)多聚酶链反应(PCR)技术:操作复杂，技术要求高，需要多种特殊仪器，只适于鸭感染后带菌期检疫、不适合于康复后的非带菌动物的鉴别。
[0006](3)血清抗体检测:检测抗体的血清学方法很多，但在鸭疫里默氏菌感染中应用较多的要是酶联免疫吸附试验。已有血清抗体检测方法不能区分血清中鸭疫里默氏菌感染和灭活菌苗免疫诱导产生的抗体，同时存在细菌血清型的差异，也就不能用于鸭疫里默氏菌感染鸭的检疫。
【发明内容】
[0007]本发明的目的在于提供了一种鸭疫里默氏菌感染鸭的酶联免疫检疫方法。
[0008]本发明的一种鸭疫里默氏菌感染鸭的酶联免疫检疫方法，包括以下步骤:
[0009](I)将鸭疫里默氏菌肽酶S8蛋白10.0yg/ml作为检测抗原在37°C振荡包被聚苯乙烯酶标板2小时；
[0010](2)洗涤后用2 %牛血清白蛋白在37 0C振荡封闭30分钟；
[0011](3)洗涤，将待检血清用磷酸盐缓冲液(0.0lM pH 7.4)按1: 200稀释后加入酶标板孔振荡反应45分钟；
[0012](4)洗涤，加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗鸭IgG溶液振荡反应45分钟；
[0013](5)洗涤，加入TMB显色液避光振荡反应15分钟；
[0014](6)加入终止液后混匀，酶标仪在波长450nm测定吸光值(OD45Q值)。
[0015]上述本发明的检疫方法，步骤(I)的检测抗原的稀释液为0.05MPH9.6的碳酸盐缓冲液;步骤(2) (3) (4) (5)中所述洗涤的洗涤液为含0.05%吐温-20的0.0IM pH7.4磷酸盐缓冲液，洗涤3次，每次3分钟；步骤(2)中2 %牛血清白蛋白的稀释液为0.0IM pH7.4磷酸盐缓冲液;步骤(6)的终止液为2.0M硫酸。
[0016]本发明的检疫方法，检测结果，当鸭血清检测的OD45Q值?0.130，则表明鸭感染鸭疫里默氏菌;检测的0D450值<0.130，则表明鸭未染鸭疫里默氏菌。
[0017]本发明的另一目的在于提供了一种鸭疫里默氏菌感染鸭的酶联免疫检疫方法的检测抗原，包括:
[0018](I)鸭疫里默氏菌肽酶S8基因或部分基因片段的原核和真核表达的重组蛋白；(2)从鸭疫里默氏菌纯培养物中分离纯化的肽酶S8蛋白及其片段。
【具体实施方式】
[0019]以下实施例用于进一步理解本发明的实质，但不以任何方式限制本发明的范围。
[0020]实施例1检测抗原的制备
[0021](I)鸭疫里默氏菌肽酶S8基因部分序列的克隆与分析
[0022]根据鸭疫里默氏菌基因组DNA序列中肽酶S8基因的核苷酸序列设计一对带有限制性内切酶位点的特异性引物SL ( 5-GGATCCCTCAATGCCTAGCGGTATGA-3 )和SR( 5-AAGCTTACACCTTTAGGCTGTTGGGT-3)，以鸭疫里默氏菌AF株(血清2型)细菌基因组DNA为模板进行PCR。
[0023]PCR 体系(25yL):1O X Buffer 2.5yL、MgCL2 (25mM) 2.0yL、dNTPs (2.5mM) 2.0yL、弓丨物 SL(1uM) 2.0yL、引物 SR(1uM) 2.0yL、Taq 酶(5U/yL)0.25yL、模板 DNA 2.0yUddH2O14.25yLo
[0024]PCR 条件:95°C 预变性 2min;94°C 变性 lmin、57°C 退火 lmin、72°C 延伸 2min，30 个循环；72°C 延伸 lOmin。
[0025]PCR产物经I %琼脂糖电泳，切胶回收目的DNA，与T载体(pUCm-T)连接构建重组质SpUC-S，转化E.coli DH5a感受态细胞，筛选阳性克隆后测序。
[0026]获得鸭疫里默氏菌AF株细菌S基因的部分序列为:
[0027]
GGATCCCTCAATGCCTAGCGGTATGACGGTAATAGGAGATCAGGGCTCTTCTATTCTAGATTGGAATCTTACAGGGG
TATATAAGAAGAGCGGAGAGTATGGTGTAAGATCTTATGCGTGGTTTATGAATCCGTTTGATGCCAATAGTATACTG
ATAACTCCTAAACTAAGAAAAGGAGCAGAAGTTCTTAACTTTAATGTATGGCATCGTTACAAAGAAAGATATGATGT
CTATATAGTGGAAGCTCCAGCTTCTGGAAACGCTCCTACAGCGGAGGAAGTGAAAGCTGGGCATAAAGTCTATACCT
TTGAAGCCACTGGAACTAATCCTACATTTAAGTTGGAGTCTGTTAATATCAAAAACTATACAAACAAAGATTTCTTT
GTAGCGTTCCACCACAGAACTAAGAAAGACGATAATGGCTTTATACTAGCATTAGATGATATAGAAGTAGGATATGA
TAACTCTGTGGACGGAAAAGTAGGGGCAACTGTAGGTACTCAAACTCTAAGCAAAGAGGCGCTTCCTGATTTTAAAG
CCGACTTCTTAAAAGGAGATAAGCTAGTAACTAGAGAGATGCTGTTACCAGAAACTTCACTGAATAGTGGTATAGGC
AGCAAAGTTTCTTTCGGAATATCTACTGTACCTCATTTAGTAGGTTACGAAGTGGTTAAAGATGGAACTAAGGTAAG
TGATATAAACGATTACAACACCCGTCTATACAATGAAACAATGACCCAAAATGGTACTTATACTTACGATGTATATG
CGGTATATTCTGACGGAGTTAAGTCTGATAAGCAAACGGTAGTTGTTAATATCACCACAATTGCTACATCAGAAGTT
GATGCTAATACAGGATTAAAGGTGTATCCAAACCCATCTAATGGTAATTTTGTAGTAGAAGCAGTTTCTACTGTATC
TGCACTGAAAGCTAGTGTTTACGATATGTCTGGAAAACAGATTTTATCCAACGAGTACAAA