补体结合的酶联免疫检测抗精子抗体方法
【专利摘要】本发明公开了一种补体结合的酶联免疫检测抗精子抗体方法，属于酶免疫分析技术领域，本发明方法是通过血清中IgG、IgA、IgM、IgD、IgE型抗精子抗体与反应孔包被的精子抗原相结合后，再与补体C3C结合，形成抗原?抗体?补体C3C免疫复合物，加入抗补体C3C标记酶，反应后加入酶底物液显色，本发明可以同时检测血清中IgG、IgA、IgM、IgD、IgE型抗精子抗体，操作简单、快速、灵敏、准确、廉价的检测方法，适用于抗精子总抗体检测，可以作为不孕不育的重要检查指标。
【专利说明】
补体结合的酶联免疫检测抗精子抗体方法
技术领域
[0001]—种血清中补体结合的酶联免疫检测抗精子抗体方法，属于酶免疫分析技术领域。
【背景技术】
[0002]抗精子抗体(AsAb)是一个复杂的病理产物，男女均可罹患，其确切原因尚未完全明了，男性的精子、精浆，对女性来说皆属特异性抗原，接触到血液后，男女均可引起免疫反应，产生相应的抗体，阻碍精子与卵子结合，而致不孕，在5-10%的不育男性的血液和精浆中确实存在精子凝集抗体和精子制动抗体。当把这种具有抗精子抗体的血清和精浆与正常精子混合，精子会发生头对头、尾对尾或混合凝集现象，或者在补体存在情况下，这种血清和精浆可以使游动的精子停止活动或者在原地颤抖。抗精子抗体的滴度越高，精子发生凝集和停止运动的现象越严重。另外，有些人抗精子抗体的滴度不高，所以表面看精子凝集现象并不严重，精子活动率也不低，可实际上在精子表面已包裹上一层抗精子抗体，妨碍了精子与卵子的结合。
[0003]正常情况下，女性的血液中是没有AsAb的，女性生殖道有一系列酶，它们能降解精子的抗原性，使其不能刺激免疫系统发生免疫反应，当这种酶系统缺陷或生殖道被破损时，可使进入的精子保持抗原性，刺激机体产生AsAb。据临床观察，AsAb阳性的女性患者，发病之前多有子宫内膜炎、阴道炎、输卵管炎等生殖系统炎症，这在输卵管阻塞不孕症中尤为多见，这些患者，常有经期、产后恶露未净、生殖器官异常出血时性交史，此种状态下性生活，精子、精液很容易与女性的血液接触，进而“激发”女性免疫系统产生抗体。另据报道，AsAb还与肠道因素及遗传因素有密切关系，AsAb可使精子在宫颈内凝集或制动，从而引起不孕。
[0004]抗精子抗体(AsAb)主要有IgG、IgM、IgA、IgD、IgE等5种类型，是一个复杂的病理产物，其作用主要表现为精子凝集、精子制动，影响精子的运送，抑制精子穿透宫颈黏液，限制精子与卵透明带粘附，抑制精子顶体的活性，使精子不易穿透包绕卵细胞的放射冠和透明带，阻碍精子与卵细胞膜的融合，阻止精子与卵子结合及影响胚胎的存活，导致死胎和流产等。
[0005]检测血清中抗精子抗体常用ELISA法，该方法采用精子抗原包被酶标板反应孔，血液中抗精子抗体与酶标法反应孔中精子抗原结合，再加入酶标记抗精子抗体，形成抗原-抗体-抗抗体，加入底物显色来检测抗精子抗体的存在。目前，国内外应用补体介导的酶联免疫法检测IgG、IgM、IgA、IgD、IgE型抗精子总抗体的方法尚无报道。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是提供一种补体参与反应的、可以同时检测血清中186、18]\1、18八、IgD、IgE型抗精子抗体的酶联免疫法，简便、快速、灵敏、准确的检测抗精子总抗体的方法。
[0007]本发明试剂盒主要由盒体(I)，酶标板(2)中设有反应孔(3)的板条，A试剂瓶(补体C3c溶液)(4)，B试剂瓶(含吐温-20的磷酸盐PBS溶液)(5)，C试剂瓶(抗补体C3c标记酶)(6)，D试剂瓶(邻苯二胺oro试剂)(7)，E试剂瓶(H2O2) (8)，F试剂瓶(硫酸溶液)(9)，塑料托架(10)及酶标板(2)均放在盒体(I)内。
[0008]本发明的原理是采用精子抗原包被酶标板反应孔，加入待检患者血清，患者血清中IgG、IgM、IgA、IgD、IgE型抗精子抗体与精子抗原结合，加入补体C3G溶液，形成抗原-抗体-补体免疫复合物，再加入抗补体C3e标记酶，该法通过形成抗原-抗体-补体C3e免疫复合物，使补体C3c结合位点多且牢固，而使结合抗补体C3c标记酶多，起到了放大作用，能同时结合IgG、IgM、IgA、IgD、IgE型抗体，因此检测灵敏度、阳性预测值均高于临床上常用的酶联免疫法检测，能检测到IgG、IgM、IgA、IgD、IgE型抗精子总抗体。
【具体实施方式】
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[0009]下面通过实施例及附图对本发明做进一步详细说明。
[0010]实施例1
[0011 ] 一、抗精子抗体酶标板的制备
[0012]将精子抗原用包被液稀释成1:200倍，加入ΙΟΟμΙ包被微孔反应板的反应孔，加入含I %小牛血清白蛋白磷酸盐缓冲液350μ1/每孔，室温封闭2小时，4°C过夜。甩尽孔内液体后，用洗涤液洗3次，每次3分钟(市售均可)。
[0013]二、酶标记抗体的制备
[0014](I)将辣根过氧化物酶5mg溶于0.5ml 0.2mol/L pH5.6HAC_NaAc缓冲液中，滴入
0.1mol/L NaKk0.25ml，4°C30分钟。
[0015](2)加入2.5%乙二醇0.51111，室温下301^11。
[0016](3)加入抗补体C3g抗体5?10mg，用l.0mmol/L pH9.5碳酸盐缓冲液调整反应液的pH至9.0左右，4°C过夜(市售均可，补体C3g市售)。
[0017](4)加入NaHB40.Iml混匀，4°C2小时后对0.0lmol/L pH7.4PBS透析，4°C过夜。加入适量中性甘油后小量分装。
[0018]三、洗涤缓冲液(pH7.4PBS)配置:0.15MKH2PO40.2克，Na2HPO4.12Η202.9克，NaCl8.0克，KCl 0.2克，Tween-20 0.05%0.5ml加蒸馏水至100ml0
【附图说明】
[0019]图1补体结合的酶联免疫检测抗精子抗体试剂盒示意图。
[0020]图2酶标板示意图。
[0021 ]图3酶标板条与反应孔示意图。
[0022]实施例2.
[0023]抗补体C3c标记酶改为补体C3c标记酶，测定中采用精子抗原包被酶标板反应孔，加入待检患者血清，患者血清中I gG、I gM、I gA、I gD、I gE型抗精子抗体与精子抗原结合，加入补体C3c标记酶，其测定效果等同实施例1。
[0024]下面以实施例1为例，具体实验过程如下:
[0025]1.样品处理取待检患者静脉血液2ml，待血液凝固后800G离心5min，分离血清待用。
[0026]2.检测方法使用前，将抗精子抗体检测试剂盒平衡至室温，取10μ1血清、阴性、阳性对照加入到酶标板孔中，震荡混匀后，至37°C水浴箱水浴20min，应用洗涤液洗涤5次，拍干，每孔加入补体C3g溶液50μ1，至37 °C水浴箱水浴20min，应用洗涤液洗涤5次，拍干，加入补体C3g标记酶50μ1，至37 0C水浴箱水浴20min，应用洗涤液洗涤5次，拍干，加入试剂D、试剂E各50μ1，至37 °C水浴箱水浴I Omin，加I滴终止液，酶标仪读取结果。
[0027]3.结果判定:可于白色背景上，直接用肉眼观察结果:反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅。也可测OD值:在ELI SA检测仪上，于490nm处，以空白对照孔调零后测各孔OD值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。
【主权项】
1.一种补体结合的酶联免疫检测抗精子抗体方法，其特征在于血清中IgG、IgA、IgM、IgD、IgE型抗精子抗体与反应孔包被的精子抗原相结合，加入补体，形成抗原-抗体-补体免疫复合物，再加抗补体C3e标记酶，反应后加入酶底物液显色，至37 °C水浴箱水浴1min，加I滴终止液，酶标仪测定Α490Γ?值。2.按照权利要求1所述的一种补体结合的酶联免疫检测抗精子抗体方法，其特征在于所述的补体为补体C3c溶液。3.按照权利要求1所述的一种补体结合的酶联免疫检测抗精子抗体方法，其特征在于所述的抗补体C3C标记酶为标记为辣根过氧化物酶的抗补体C3C抗体。4.按照权利要求1所述的一种补体结合的酶联免疫检测抗精子抗体方法，其特征在于所述的酶底物液，其中一试剂瓶为邻苯二胺(Oro)试剂，另一试剂瓶为H2O2。
【文档编号】G01N33/543GK106093376SQ201610571240
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年8月29日
【发明人】李立和, 丁弘, 张超
【申请人】天津市宝坻区人民医院