检测二氯喹啉酸的酶联免疫试剂盒及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及酶联免疫检测技术，具体涉及一种用于检测二氯喹啉酸的酶联免疫试 剂盒及其应用，可定性、定量检测土壤中二氯喹啉酸的残留量。
【背景技术】
[0002] 二氯喹啉酸是由德国巴斯夫公司开发的新型喹啉酸类激素型除草剂，具有选择性 强和持效期长的特点。二氯喹啉酸在一年生杂草和禾本科作物之间有明显的选择性，可用 于秧前和秧后的水稻田或直播水稻田的杂草防除，是我国稻田主要除草剂品种之一。由于 二氯喹啉酸显酸性，在酸性土壤中降解缓慢，容易给后茬敏感作物造成严重危害，特别在水 稻与烟草轮作地区，可造成烟草生长畸形。伴随二氯喹啉酸应用量的逐年增长，应用范围的 逐年扩大，由于不合理的使用而导致农作物产生药害的事件也常有发生。在实际应用中，水 稻田施用二氯喹啉酸后，经过半年的降解，二氯喹啉酸仍会有相当累积。水稻田施用二氯喹 啉酸后的近300天内，除水稻外，不能种植任何作物;两年内不能种植烟草、茄子、番茄、胡萝 卜、芹菜等作物，不能用施过二氯喹啉酸的水灌上述作物。为了缓解因土壤残留二氯喹啉酸 而致烟草畸形生长，减少由此而造成的经济损失，种植前检测植烟土壤中二氯喹啉酸的含 量显得尤为重要。
[0003] 目前常用的二氯喹啉酸检测方法主要是仪器方法，如高效液相色谱法、液相色谱 串联质谱法，采用这些分析方法需要昂贵的仪器和专门的技术人员，样品前处理过程复杂 且花费高、费时长，难以满足大量样品和现场样品快速检测的需要。因此，开发一种不受检 测设备限制并且能够实现对大批量样品进行快速检测的产品和方法成为迫切需要解决的 问题。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的正是针对上述现有技术状况而提供一种能够检测土壤中二氯喹啉 酸残留量的酶联免疫试剂盒，并提供一种高效、准确、简便、适于大批量样品筛选的定性、定 量检测方法，应用本发明的酶联免疫法测定土壤中二氯喹啉酸的残留量，具有检测限低、特 异性强、操作简便、检测速度快、检测成本低，易于推广等优点。
[0005] 本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：本发明的试剂盒包括:包被有包被 原的酶标板、二氯喹啉酸标准品溶液、二氯喹啉酸抗体、酶标二抗、底物显色液、终止液、洗 涤液、复溶液，所述包被原为二氯喹啉酸偶联抗原，所述酶标二抗为酶标记的二氯喹啉酸抗 抗体，所述二氯喹啉酸偶联抗原是由二氯喹啉酸半抗原与载体蛋白偶联得到，所述二氯喹 啉酸半抗原是由二氯喹啉酸与溴乙酰氯反应得到，二氯喹啉酸半抗原分子结构式为：
[0006] 所述载体蛋白可为鼠血清蛋白、甲状腺蛋白、牛血清白蛋白、兔血清蛋白、人血清 蛋白、卵清蛋白、血蓝蛋白或纤维蛋白原。
[0007] 所述二氯喹啉酸抗体是以二氯喹啉酸偶联抗原作为免疫原制备获得，所述二氯喹 啉酸抗体为二氯喹啉酸单克隆抗体或二氯喹啉酸多克隆抗体，其中优选二氯喹啉酸单克隆 抗体。
[0008] 所述酶标二抗的标记酶为辣根过氧化物酶或细菌提取碱性磷酸酯酶，其中优选辣 根过氧化物酶;酶标二抗是由酶和二氯喹啉酸抗抗体偶联得到的。
[0009] 当标记酶为辣根过氧化物酶时，所述底物显色液由底物液A液和底物液B液组成，A 为过氧化氢或过氧化脲，B液为邻苯二胺或四甲基联苯胺，所述终止液为卜2 mol/L的硫酸 溶液或盐酸缓冲液；当标记酶为细菌提取碱性磷酸酯酶时，所述底物显色液为对硝基磷酸 盐缓冲液，所述终止液为1~2 mol/L氢氧化钠溶液。
[0010] 所述二氯喹啉酸标准品溶液6瓶，浓度分别为0 yg/UO.5 yg/UU yg/LJA μ g/L，13.5 yg/L，40.5 yg/L〇
[0011] 所述洗涤液优选为pH值为7.4，含有0.5%~1.0%吐温-20、0.01%Q~0.03%。叠氮化钠 防腐剂、〇. 1~0.3 mol/L的磷酸盐缓冲液，其中的百分比为重量体积百分比，单位g/mL。
[0012] 所述复溶液优选为?11值为7.0、0.02 111〇1/1的磷酸盐缓冲液。
[0013]本发明中酶标板的制备过程为：用包被缓冲液将包被原稀释成20 yg/mL，每孔加 入100 yL，25°C避光孵育2 h或4°C过夜，倾去孔中液体，用洗涤液洗涤2次，每次30 s，拍干， 然后在每孔中加入150~200 yL封闭液，25 °C避光孵育卜2 h，倾去孔内液体拍干，干燥后用 铝膜真空密封保存。
[0014] 其中，在酶标板制备过程中所用到的包被缓冲液为pH值为9.6,0.05 mol/L的碳酸 盐缓冲液，封闭液为pH值为7.1~7.5，含有1%~3% (g/mL)酪蛋白、0.1~0.3 m〇VL的磷酸盐缓 冲液。
[0015] 本发明的检测原理为： 本试剂盒采用间接竞争ELISA方法，在酶标板微孔条上预包被二氯喹啉酸偶联抗原，加 入样本溶液或标准品溶液后，再加入二氯喹啉酸单克隆抗体溶液，样本中残留的二氯喹啉 酸和酶标板微孔条上预包被的偶联抗原竞争二氯喹啉酸单克隆抗体，加入酶标二抗进行放 大作用，用显色液显色，样本吸光度值与其所含残留物二氯喹啉酸的含量成负相关，与标准 曲线比较，再乘以其对应的稀释倍数，即可得出样本中二氯喹啉酸的残留量。
[0016] 本发明还提供了一种应用上述酶联免疫试剂盒检测二氯喹啉酸的方法，它包括步 骤： (1) 样品前处理； (2) 用试剂盒进行检测； (3) 分析检测结果。
[0017] 本发明检测二氯喹啉酸的酶联免疫试剂盒主要采用间接竞争ELISA方法定性或定 量检测样品中二氯喹啉酸残留量;对样品的前处理要求低，样品前处理过程简单，能同时快 速检测大批量样品；主要试剂以工作液的形式提供，检验方法方便易行，具有检测限低、特 异性高、操作简便、灵敏度高、精确度高、准确度高等特点。本发明的酶联免疫试剂盒，结构 简单、使用方便、价格便宜、携带便利、检测方法高效、准确、简便、适于大批量样品筛选的定 性、定量检测。
【附图说明】
[0018] 图1:二氯喹啉酸半抗原合成路线图。
[0019] 图2:试剂盒标准曲线图。
【具体实施方式】
[0020] 下面结合具体的实施例来进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本 发明，而不用来限制本发明的范围。
[0021] 实施例1试剂盒组分的制备 1、二氯喹啉酸半抗原的制备 取0.43 g溴乙酰氯，加10 mL氯仿溶解，加30.28 g A1C13搅拌，室温反应2 h，滴加含有 1.0 g二氯喹啉酸的吡啶溶液20 mL，50 °C反应4 h。停止反应，旋蒸，除去有机溶剂，加水溶 解，加稀盐酸调节pH=5，乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥，浓缩，得到红色油状物，上硅胶柱， 石油醚/乙酸乙酯(v/V，1/1)，洗脱分离，得到溴乙酰化二氯喹啉酸半抗原产物1.38 g，收率 92%〇
[0022] 取上述半抗原经核磁共振氢谱鉴定，1H M1R(CDC13,300 ΜΗΖ)δ:4.353 (2,2H)， 8.330 (7，lH，d，J=3.832)，8.812 (9，lH，dd，J=3.832，J=1.700)，8.703 (15，lH，d，J= 1.700)化学位移δ=4.35的为间隔臂上亚甲基的氢的共振吸收峰，除原料本身氢的特征吸收 峰外，该吸收峰的存在证明间隔臂偶联成功。
[0023] 2、抗原的制备 免疫原制备--二氯喹啉酸半抗原与牛血清白蛋白（BSA)(也可选用其它蛋白如人血 清蛋白、鼠血清蛋白）偶联得到免疫原。
[0024] 取22 mg半抗原，溶解于0.8 mL Ν，Ν-二甲基甲酰胺(DMF)中，搅拌，溶解澄清，得到 反应液Α;称取BSA 30 mg，使之充分溶解在4 mL 0.1 mol/L柠檬酸盐缓冲液(CB，pH 9.6) 中，将反应液A逐滴缓慢滴加到蛋白溶液中，并于室温下搅拌24 h，用0.01 mol/L磷酸盐缓 冲液(PBS)4 °C透析3 d，每天换3次透析液，以除去未反应的小分子物质，得到免疫原。 [0025] 包被原制备一一二氯喹啉酸半抗原与卵清蛋白（0VA)(也可选用其它蛋白如血蓝蛋 白、纤维蛋白）偶联得到包被原。
[0026] 取18 mg半抗原，溶解于1 mL DMF中，溶解澄清，得到反应液A;称取0VA 30 mg，使 之充分溶解在6 11^0.1111〇1/108(?!19.6)中，将反应液4逐滴缓慢滴加到蛋白溶液中，并 于室温下搅拌24 h，用0.01 mol/L PBS 4 °C透析3 d，每天换3次透析液，以除去未反应的 小分子物质，得到包被原。
[0027] 3、二氯喹啉酸单克隆抗体的制备 动物免疫:将上述步骤得到的免疫原注入到Balb/c小鼠体内，免疫剂量为150 yg/只， 使其产生抗血清。
[0028] 细胞融合和克隆化：小鼠血清测定结果较高后，取其脾细胞，按8:1(数量配比）比 例与SP2/0骨髓瘤细胞融合，采用间接竞争ELISA测定细胞上清液