一种检测动物源食品中甲巯咪唑残留的酶联免疫试剂盒及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及酶联免疫检测技术，具体涉及一种检测甲琉咪哇的酶联免疫试剂盒， 其特别适用于动物源食品中甲琉咪哇残留的检测。 技术背景
[0002] 甲琉咪哇是甲亢的常用治疗药物，能改变动物体内的内分泌，动物在饲用含甲琉 咪哇的饲料后，在尿液、鸡肉和组织中会有不同程度的残留，欧盟等国家已明确将其列入动 物园食品中禁用药物。目前，激素类物质已被大部分国家禁止在养殖业中使用，并不得在食 品中检出。但国内对畜产品中甲琉咪哇等违禁药物残留的检测几乎是空白，根据我国对动 物源产品残留监控规定及有关进口国的要求，研究各种检测方法已成为当务之急。
[0003] 目前，检测甲琉咪哇残留量的方法主要是高效液相色谱法（HPLC)，由于复杂的仪 器设备和繁琐的过程W及对检验人员的高技能要求，不适合现场监控和大量样本的筛查。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于针对上述不足提供一种用于动物源食品中甲琉咪哇残留检测 酶联免疫试剂盒，其操作简单适合现场大批量样品的筛选。
[0005] 本发明试剂盒，它含有： (1) 包被有包被原的酶标板（包被原为抗原、抗体或抗抗体）； (2) 酶标记物（为酶标记半抗原、酶标记抗体或酶标记抗抗体）； (3) 甲琉咪哇抗体工作液（当酶标板上包被抗原且酶标记物为酶标记抗抗体或酶标板 上包被抗抗体且酶标记物为酶标抗原时含有）； (4) 甲琉咪哇标准品溶液； (5) 底物显色液； (6) 终止液； (7) 浓缩洗涂液； (8) 浓缩复溶液； 本发明提供的检测甲琉咪哇残留量的酶联免疫试剂盒，包括甲琉咪哇特异性抗体工作 液及预包被包被原的酶标板和酶标记物工作液，所述酶标记物为酶标记的抗抗体，酶标记 甲琉咪哇半抗原或酶标记甲琉咪哇特异性抗体；所述抗抗体为羊抗鼠抗抗体或羊抗兔抗抗 体。
[0006] 所述酶标记物的标记酶为辣根过氧化物酶，酶标记的羊抗鼠抗抗体是采用混合 酸酢或碳化二亚胺法将标记酶与抗抗体进行偶联得到的。
[0007] 所述甲琉咪哇特异性抗体为甲琉咪哇单克隆抗体，他们均是用甲琉咪哇半抗原与 载体蛋白采用混合酸酢法得到的偶联物作为免疫原得到的，所述甲琉咪哇单克隆抗体优选 甲琉咪哇鼠单克隆抗体。
[0008] 为了更方便现场监控和大量样本筛查，所述试剂盒还包括甲琉咪哇标准品溶液、 显色剂、终止液、浓缩洗涂液、浓缩复溶液。
[000引所述洗涂液优选浓缩洗涂液为抑7.广17. 7,含有0. 8%~1. 2%吐温80和 0. 03^10. 05%硫柳隶防腐剂，0. 02^10. 04mol/L磯酸盐缓冲液，所述百分比为重量体积百分 比。
[0010] 当酶标记物的标记酶为辣根过氧化物酶，底物显色液A为过氧化氨或过氧化脈， 底物显色液B为邻苯二胺或四甲基联苯胺，终止液为广2mol/L硫酸或盐酸缓冲液； 所述复溶液为含有0.08~10. 12%吐温20、3~18%卵清蛋白、0.2~0.5mol/L磯酸盐缓冲 液，所述百分比为重量体积百分比。 本发明中酶标板的制备过程为用缓冲液将包被原稀释成0. 2^0. 3 μ g/ml，每孔加入 100 μ L 37°C温育化或4°C过夜，倾去包被液，用稀释后的洗涂液洗涂两次，每次30s，拍干， 然后在每孔中加入150~200 μ L封闭液，37°C温育广化，倾去孔内液体拍干，干燥后用铅膜 真空密封保存。
[0011] 本发明中抗原的合成过程： 1. 半抗原的合成 甲琉咪哇半抗原是将孕丽和玻巧酸酢通过反应得到的 2. 甲琉咪哇抗体的制备 将甲琉咪哇半抗原与载体蛋白采用碳化二亚胺法进行偶联得到免疫原 本发明所述试剂盒中甲琉咪哇标准品溶液；标注品溶液6瓶，为0 μ g/l，0. 3 μ g/l， 0. 9 μ g/L, 2. 7 μ g/L, 8. 1 μ g/L, 24. 3 μ g/L〇
[0012] 本发明的检测原理为： 当在微孔条上预包被甲琉咪哇抗原时，加入样本溶液或标准品溶液后，随即加入酶标 二抗，再加入甲琉咪哇特异性抗体溶液，样本中残留的甲琉咪哇与酶标板上包被的甲琉咪 哇抗原竞争孕丽特异性抗体，酶标记抗抗体进行放大作用，用显色液显色，样本吸光值与甲 琉咪哇的含量成负相关，与标准曲线比较可粗略判断样品中甲琉咪哇残留量的浓度范围。
[0013] 本发明还提供了一种应用上述酶联免疫试剂盒检测动物源食品中甲琉咪哇残留 的方法，它包括步骤： (1) 样品前处理； (2) 用试剂盒进行检测； (3) 分析检测结果。
[0014] 样本前处理主要是为了从样本中获得甲琉咪哇溶液，从而用于后续的检测。样本 前处理的方法： 称取2. 0+(-)0. 5牛肉至50ml聚苯己帰离必管中，加入5~8ml己酸己醋，振荡器振荡 10min，3000r W上离必5min，取上清液广3ml，至10ml干净的玻璃试管中，于50~6(TC水浴 氮气流下吹干，加入广3ml样本复溶液，用润旋仪润旋Imin，取50 μ 1用于分析。
[0015] 本发明中用试剂盒检测时，当包被原为甲琉咪哇抗原时，向酶标板微孔中加入标 准品溶液或样本溶液，随即加入酶标二抗，再加入抗体工作液，温育后洗涂拍干，显色，终 止，用酶标仪测定吸光度值。本发明中的结果分析过程为：用所获得的每个浓度的标准品溶 液的吸光度平均值度）除W第一个标准品溶液（0标准）的吸光度值度0)再乘W 100%，即 百分吸光度值，计算公式为： 百分吸光度值饼)=度/B0)X100% W甲琉咪哇标准品的浓度（μ g/L)的半对数值为X轴，百分吸光度值为Y轴，绘制标准 曲线图，用同样的办法计算样品中的百分吸光度值，相对应的每个样品的浓度则可从标准 曲线上读出样本中甲琉咪哇的残留量。
[0016] 本发明中检测结果的分析也可W采用回归方程法，计算出样品溶液的浓度。
[0017] 本发明中检测结果的分析还可W利用计算机软件，此法更便于大量样品的快速分 析，整个检测过程只需不足比可W完成。
[0018] 本发明检测动物源食品中甲琉咪哇残留的酶联免疫试剂盒主要采用间接竞争 ELISA方法定性或定量检测出样品中的甲琉咪哇的残留量，对样品前处理要求低，样品前处 理过程简单，能同时快速检测出大批量样品，主要试剂W工作液的形式提供，检验方法方便 易行，具有特异性高，灵敏度高，精确度高，准确度高等特点。本发明的酶联免疫试剂盒结构 简单，使用方便，携带便利，检测方法高效准确，适于大批量样品筛选检测。本发明的试剂盒 将在甲琉咪哇残留的检测中发挥重要作用。
【附图说明】
[0019] 图1甲琉咪哇化学结构通式。
[0020] 图2甲琉咪哇试剂盒的标准曲线。
【具体实施方式】
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