021] 下面结合具体的实施步例来进一步阐述本发明。
[0022] 1.酶标板的制备 用包被缓冲液将甲琉咪哇抗原稀释成0. 20μ邑/111以每孔加入100μ 1，37°C温育两小 时，倾去包被液，用稀释的浓缩洗涂液洗涂两次，每次30s，拍干，然后再每孔加入200 μ 1封 闭液，37°C温育沈，倾去孔内液体，干燥后用铅膜真空密闭保存。
[0023] 2.组建检测甲琉咪哇残留的酶联免疫试剂盒，使其包括下述组分： (1) 包被甲琉咪哇抗原的酶标板 (2) 用辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗抗体 (3) 甲琉咪哇抗体工作液 (4) 甲琉咪哇标准品6瓶，浓度分别为0 μ g/l，0. 3 μ g/l，0. 9 μ g/l，2. 7 μ g/l， 8. 1 μ g/l，24. 3 μ g/L ; (5) 底物显色液由A液和B液组成，底物显色A液为过氧化脈，底物显色B液为四甲基 联苯胺 (6) 终止液为2mol/L盐酸 (7) 浓缩洗涂液为为抑7.广17. 7,含有0. 8%~1. 2%吐温80和0. 03~10. 05%硫柳隶防腐 剂，0. 02^10. 04mol/L磯酸盐缓冲液，所述百分比为重量体积百分比； 做浓缩复溶液为含有0. 08~10. 12%吐温20、3~18%卵清蛋白、0. 2~0. 5mol/L磯酸盐 缓冲液，所述百分比为重量体积百分比。
[0024] 3.样品中甲琉咪哇残留的检测： (1)称取2. 0+(-)0. 5鸡肉至50ml聚苯己帰离必管中，加入5~8ml己酸己醋，振荡器振 荡10min，3000r W上离必5min，取上清液广3ml，至10ml干净的玻璃试管中，于50~6(TC水 浴氮气流下吹干，加入广3ml样本复溶液，用润旋仪润旋Imin，取50 μ 1用于分析。
[0025] 似用试剂盒检测： 向包被有甲琉咪哇抗原的酶标板微孔中加入甲琉咪哇标准品溶液或样本溶液50 μ 1， 随即加入酶标二抗50μ 1，再加入甲琉咪哇抗体工作液50μ 1，用盖板膜封板，37°C恒温箱 中反应30min，倒出孔内液体，每孔加入250 μ 1洗涂液，30s后倒出孔内液体，如此反复操作 洗板5次，用吸水纸拍干，每孔加入底物显色A液过氧化脈，底物显色B液四甲基联苯胺，轻 轻振荡混匀，37°C恒温箱显色15min，每孔加入2mol/L终止液盐酸50 μ 1，轻轻振荡混匀，用 酶标仪设定在450nm处，测定每孔吸光度值（0D值）。
[0026] 所绘的标准曲线如附图2所示，I巧0=1.化g/ml 4.标准品精密度试验： 分别从Η个不同的时间段制备的酶标板中各抽出一批酶标板，每批各抽取10个试剂 盒，每板各抽出20个微孔，测定2. 7 μ g/L标准溶液的吸光度值，计算变异系数。
[0027] 表1标准可重复性试验（CV%)
通过上述试验结果可W看出，每批试剂盒各10次标准品变异系数在4. 6%~11. 2%之间， 符合精密度小于或等于25%的规定。
[0028] 5.样本准确度实验： 取两个浓度的孕丽标准品分别为10 μ g/kg，20 μ g/kg，分别对样本进行添加回收实验， 每个浓度做4个平行，分别计算准确度。
[0029] 表2试剂盒的准确度
结果表明牛肉样本的添加回收率在82. 0%~89. 4%之间。
[0030] 7.交叉反应率实验 选择与甲琉咪哇有类似结构和类似功能的药物测定交叉反应率，通过各种药物的标准 曲线分别得到其50%的抑制浓度，用下试计算试剂盒对其他药物的交叉反应率。交叉反应 率佩=(引起50%抑制甲琉咪哇的浓度/引起50%抑制的类似物度）X 100%。
[0031] 表3试剂盒的特异性： 药物名称 交叉反应率饼） 甲琉咪哇 100% 硫脈嚼巧 <2. 5% 甲基硫氧嚼巧 <1% 丙基硫氧嚼巧 <0. 5% 苯基硫氧嚼巧 <0. 5% 8.试剂盒保存条件为2^8Γ，经过6个月的测定，试剂盒的最大吸光度值（零标准）、 50%抑制浓度、甲琉咪哇添加实际测定值均在正常范围内。考虑到在运输和使用过程中，会 有非正常保存条件出现，将试剂盒在37°C保存条件下放置6天，进行加速老化试验，结果表 明该试剂盒各项指标完全符合要求。考虑到试剂盒冷冻情况发生，将试剂盒放入-2(TC冰箱 冷冻5天，测定结果页表明试剂盒各项指标完全正常，从W上结果可W得出，试剂盒可W在 2^8 °C可W保存6个月。
【主权项】
1. 一种检测动物源食品中甲巯咪唑残留的酶联免疫试剂盒，其特征在于：其组成成分 及比例如下： 包括包被板、校准品、酶标记物工作液、底物液A、底物液B、终止液、浓缩洗涤液、浓缩 提取液；所述包被板为孔底包被有甲巯咪唑抗原，所述酶标记物为酶标记甲巯咪唑抗体。2. 如权利1所述试剂盒，其特征在于所述甲巯咪唑抗体为单克隆抗体。3. 如权利要求1或2所述的试剂盒其特征在于酶标记物的标记酶为辣根过氧化物酶， 底物显色液A为过氧化氢或过氧化脲，底物显色液B为邻苯二胺或四甲基联苯胺，终止液为 l~2mol/L硫酸或盐酸缓冲液。4. 如权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于：浓缩洗涤液为pH7. 1~7. 7,含有 0. 8%~1. 2%吐温80和0. 03~0. 05%硫柳汞防腐剂、0. 02~0. 04mol/L磷酸盐缓冲液：浓缩复 溶液为含有〇. 〇8~0. 12%吐温20、3~8%卵清蛋白、0. 2~0. 5mol/L磷酸盐缓冲液，甲巯咪唑标 准品的浓度分别为 〇μg/L，0. 3μg/L，0. 9μg/L，2. 7μg/L，8. 1μg/L，24. 3μg/L，所述百分 比为重量体积百分比。5. -种检动物源食品中甲巯咪唑残留的方法，包括步骤： (1) 样品前处理； (2) 用权利要求1试剂盒进行检测； (3) 分析检测结果。
【专利摘要】本发明涉及一种动物源食品中甲巯咪唑残留检测酶联免疫试剂盒，其组成成分及比例如下：包括包被板、标准品、酶标记物工作液、底物液A、底物液B、终止液、浓缩洗涤液、浓缩提取液。本发明试剂盒的灵敏度为0.3ppb，精密度：批内变异系数(CV%)，CV%<5%：批间变异系数(CV%)CV%<10%：准确度以回收率表示，回收率在80%~110%之间。IC50范围：在0.3~0.5ppb之间，线性相关系数|r|：不小于0.9900，具有使用范围广、使用方便、检测准确的优点。
【IPC分类】G01N33/577
【公开号】CN105486869
【申请号】CN201410523551
【发明人】杜道林, 洪霞, 刘静
【申请人】江苏维赛科技生物发展有限公司
【公开日】2016年4月13日
【申请日】2014年10月8日