一种猪札幌病毒总抗体elisa检测试剂盒及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物医学技术领域，具体涉及一种猪札幌病毒总抗体ELISA检测试剂盒及其制备方法。
【背景技术】
[0002]札幌病毒(Sapovirus，SaY)属于杯状病毒科(0&1:[0；^;[1^(136)、札幌样病毒属(Sappora-like virus)，是一种单股正链RNA病毒。能够引起人和动物的急性病毒性胃肠炎及腹泻，通常以粪-口途径传播。
[0003]猪SaY分布广泛，包括欧洲、亚洲及美洲都检测到了该病毒，可以感染各年龄阶段的猪，1月龄左右断奶仔猪最易感，成年猪感染后很少出现临床症状，对养猪业造成了一定的威胁和损失。最新研究显示，对于不同基因型的人源和动物源的SaY在遗传上和抗原特性上有相似之处，且已发现人源和猪源的SaY重组毒株?，说明SaY可能存在跨种传播能力，对人类公共卫生构成潜在的威胁。因此对札幌病毒进行流行病学监测就显得尤为重要。
[0004]目前，国内外对于猪源札幌病毒的检测方法还不成熟，还没有检测猪SaY抗体的商品化试剂盒，而是主要集中在病毒形态及病毒RNA的检测等方法上。电镜诊断用于病毒粒子结构观察，可直接检测标本，但机器价格昂贵，技术要求高，不适用于大量的病毒诊断;RT-PCR技术用于检测病毒RNA，灵敏度较高，但技术要求高，设备及操作环境要求也较高;ELISA技术广泛应用于检测病毒的抗原抗体，特异性强、重复性好，可用于大范围的流行病学监测。
【发明内容】
[0005]针对现有技术的不足，本发明旨在提供一种猪札幌病毒总抗体ELISA检测试剂盒的制备方法，操作步骤简便，试剂成本较低，检测灵敏度较高，尤其适合于猪血清标本的快速批量检测，为猪SaV流行病学调查奠定基础。
[0006]为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案:
[0007]—种猪札幌病毒总抗体ELISA检测试剂盒，包括含有SaV包被抗原的酶标板和SaV标记抗原-HRP(辣根过氧化物酶)标记物，其中，所述SaV包被抗原为SaV swCH430株P蛋白片段，SaV标记抗原为SaV swCH430株S蛋白片段。
[0008]—种制备上述猪札幌病毒总抗体ELISA检测试剂盒的方法，包括如下步骤:
[0009]S1制备SaV包被抗原以及制备SaV标记抗原，所述SaV包被抗原为SaV swCH430株P蛋白片段，SaV标记抗原为SaV swCH430株S蛋白片段；
[0010]S2通过SaV标记抗原和HRP的偶联，制备得到SaV标记抗原-HRP标记物；
[0011]S3采用碳酸盐缓冲液以一定比例将SaV包被抗原稀释，ΙΟΟμ?ν孔加入到酶标板，封装于加有干燥剂的铝膜袋中，包被完毕。
[0012]需要说明的是，所述步骤S1具体方法如下:
[0013]1.1)PCR扩增猪源swCH430株SaV 0RF2基因部分的两个片段:SaV swCH430株S片段和SaV swCH430株P片段；
[0014]SaV swCH430株S片段设计引物为:
[0015]FS 57-GGAATTCCATATGGAGGCGCCTGCCC-375140-5156；
[0016]RS 5,-CCGCTCGAGGTTTGGAGGCTTGAGCAGGGTGA-3, 5775-5798；
[0017]FS为S片段上游引物，带有Nde I酶切位点，RS为片段下游引物，带有Xho I酶切位占.
[0018]SaV swCH430株P片段设计引物为:
[0019]FP 57-CGGGATCCATGCAAACCATGGAAGCAGGGCTTGACCCT-37 5799-5826；
[0020]RP 57-CGGAATTCTCGTGAGCTGTGAAGGGAC-376755-6774；
[0021 ] FP为P片段上游引物，带有BamH I酶切位点，RP为P片段下游引物，带有EcoR I酶切位点；
[0022]1.2)PCR扩增S片段和P片段后回收，采用相应的内切酶分别进行双酶切，获得的酶切片段分别连接到PMD18-T载体，并转化大肠杆菌DH5a，挑取转化子，小提质粒，用相应的内切酶分别酶切鉴定并进行测序，将测序正确的阳性克隆质粒分别命名为T-S和T-P;
[0023]1.3)将pET30a( + )与步骤1.2)中鉴定得到的测序正确的阳性克隆质粒T-S和T-P分别以相应的内切酶消化，进行琼脂糖电泳，胶回收目的片段后分别进行连接，将连接产物分别转化大肠杆菌JM109，挑取转化子，小提质粒，用相应的限制性内切酶进行酶切鉴定，构建得到可在大肠杆菌中表达的重组质粒，命名为pET-S和pET-P;
[0024]1.4)阳性重组质粒pET-S和pET-P分别转化BL21(DE3)感受态细胞，挑选单克隆菌落于卡那霉素LB培养液中培养10h;再各自取过夜培养液100yL，以1:100的比例接种于10mL卡那霉素抗性的LB中进行菌体活化，37°C振荡培养至0D600 = 0.8时，加入终浓度为0.8mmol/L的IPTG分别诱导表达6h;然后将培养物4°C6000rmp离心15分钟收集菌体，菌体采用20mL l%Triton-X-100的PBS悬浮，超声波破碎，4°C12000rmp离心30分钟，收集沉淀得到表达的重组蛋白；
[0025]1.5)对步骤1.4)得到的重组蛋白分别进行纯化，得到目的蛋白；
[0026]1.6)目的蛋白进行SDS-PAGE，当条带与预期大小相一致，则分别命名为P蛋白和S蛋白，P蛋白即为SaV包被抗原，S蛋白即SaV标记抗原。
[0027]进一步需要说明的是，步骤1.6)具体为:
[0028]1.6.1)取50mL步骤1.4)中经诱导表达6h得到的表达产物，分别在4°C下12000g离心2min收集菌体沉淀，加入5mL lmmol/L、PH7.4的PBS充分悬浮，在4°C下以6000rpm/min的速度离心15min，保留沉淀，如此反复离心3次；
[0029]1.6.2)分别用5mL PBS重悬菌体进行超声破碎，破碎条件为功率40%，超声3s，间歇3s;破碎lOmin;然后将裂解液12000g离心30min，收集包涵体沉淀，然后用结合缓冲液溶解沉淀，其中所述结合缓冲液包含8mol/L尿素、lmmol/L EDTA和20mmol/L Tris；
[0030]1.6.3)先用结合缓冲液平衡Ni Sepharose? 6 Fast Flow重力柱，再将步骤
1.6.2)溶解得到的包涵体溶液过三遍平衡的Ni2+重力柱；
[0031 ] 1.6.4)分别用10倍柱体积的PH8.0的磷酸盐缓冲液和PH7.8的磷酸盐缓冲液先后经过重力柱；
[0032]1.6.5)用洗脱液洗脱Ni2+重力柱上的蛋白，同时将纯化的蛋白和各自的镍柱进行蛋白电泳分析结果，其中，所述洗脱液通过250mmol咪唑溶解于1L PH8.0的磷酸盐缓冲液获得。
[0033]进一步需要说明的是，步骤1.6)中，采用GE公司Ni SepharoseTM 6 Fast Flow蛋白纯化柱纯化。
[0034]需要说明的是，步骤S2中，SaV标记抗原和HRP的偶联具体采用Na104氧化法，包括步骤如下:
[0035]2.1)将步骤S1中所得的SaV标记抗原于PBS溶液中4°C透析过夜；
[0036]2.2)紫外分光光度计测定SaV标记抗原浓度；
[0037]2.3)采用分析天平秤取10mg HRP溶于2mL超纯水中制备终浓度为5mg/mL的HRP溶液，分析天平秤取Na104，溶于超纯水中制备终浓度为20mg/mL的Na104溶液备用；
[0038]2.4)缓慢滴加225yL Na104溶液于2mL HRP溶液中，室温下避光静置20分钟；
[0039]2.5)加入20yL乙二醇于HRP混合溶液中，之后室温下静置30分钟，得到活化好的HRP溶液；
[0(Η0] 2.6)取111^ 2.lmg/mL的SaV标记抗原缓慢逐滴加入到活化好的HRP溶液中，得到SaV标记抗原-HRP结合物；
[0041 ] 2.7)将3&￥标记抗原-!11^结合物于5011111101/1 CB pH9.6的溶液中4°C避光透析2.5个小时；
[0042]2.8)分析天平称量NaBH4溶于水中，制备终浓度为4mg/mL的NaBH4溶液；
[0043]2.9)向步骤2.7)的透析袋中加入162yL的NaBH4溶液，室温下在摇床上轻轻震动2个小时；
[0044]2.10)在PBS溶液中4°C透析过夜；
[0045]2.11)透析结束后1:1比例加入甘油，-20度保存，即为SaV标记抗原-HRP标记物。
[0046]需要说明的是，步骤S3的具体步骤如下:
[0047]采用50mmol/L、pH9.5的碳酸盐缓冲液将SaV包被抗原稀释至6yg/mL，然后1:2000倍稀释加入SaV包被抗原，100yL/孔加入到酶标板，4°C包被过夜;次日采用PBST洗涤液洗板三次，所述 PBST 洗涤液包括 10mmol/L PB、1