一种定性检测丙型肝炎抗体的试剂盒及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及丙型肝炎抗体的检测领域，具体为一种定性检测丙型肝炎抗体的试剂 盒及其制备方法和应用，尤其是一种基于磁微粒分离化学发光法定性检测人丙型肝炎抗体 (anti-HCV)的试剂盒及其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002] 丙型肝炎病毒化CV)是诱发丙型肝炎的罪魅祸首，其通过血液传播。HCV感染常导 致慢性肝炎和肝硬化，并可能进展为肝细胞肝癌。临床常伴有冷球蛋白血症和各种风湿性 疾病的症状表现。
[0003] 丙型肝炎病毒化CV)是黄病毒科的一种单链正股RNA病毒，有衣壳。病毒基因组长 约9.化b，编码包括结构区和非结构区在内的3000个氨基酸多肤。如同其他RNA病毒，HCV在 复制过程中发生变异而形成多种变异株。全世界至少报道了 11个不同的基因型和多种亚型 W及病毒变异体。不同基因型的病毒可能影响疾病的严重程度和治疗效果。丙型肝炎病毒 主要通过被污染的血液和血制品传播，通过人体液传播的概率较小。
[0004] HCV抗体(Anti-HCV)检测可单独使用，也可W同其他检测（如HCV-RNA)联合使用， 检测个体是否感染丙型肝炎病毒和筛选被HCV污染的血液和血制品。
[000引在国内，丙型肝炎抗体检测临床上主要W间接捕获法检测丙型肝炎抗体应用为 主，且大部分是板式酶联免疫法，灵敏度低，特异性价差，给患者带来很大的精神及经济负 担。具有自主知识产权的直接标记双抗原夹屯、磁微粒酶促化学发光方法的试剂盒目前应用 还较少，商品化的试剂盒主要停留在间接捕获法检测丙型抗体或者板式的水平上。间接捕 获法由于人血清中含有大量的人IgG干扰，很容易出现假阳性，灵敏度较低、特异性较差;板 式检测方式，操作复杂，灵敏度低，同时也不利于高通量的全自动检测。
[0006] 因此，有待开发直接标记的双抗原丙型肝炎抗体(anti-HCV)检测灵敏度高与特异 性强，并能降低检测成本的检测技术。
【发明内容】
[0007] 本发明要解决的技术问题是克服现有的丙型肝炎抗体检测的灵敏度低，特异性价 差、成本昂贵的缺陷，提供一种灵敏度高、特异性强、成本低的直接标记双抗原丙型肝炎抗 体(anti-HCV)检测法。
[0008] 为了解决上述技术问题，本发明提供了如下的技术方案：
[0009] -种定性检测丙型肝炎抗体的试剂盒，包括定标液、阴性对照品、阳性对照品、抗 试剂、磁微粒试剂和发光底物；
[0010] 其中所述定标液、阴性对照品、阳性对照品采用含蛋白的缓冲液溶解人血清纯化 的丙型肝炎抗体，并用含新生牛血清的缓冲液按一定比例稀释得到；
[0011] 所述抗试剂是将异硫氯酸巧光素标记的重组的丙型肝炎抗原和碱性憐酸酶标记 的重组的丙型肝炎抗原，按比例加入到Tris盐缓冲液中制得；
[0012]所述磁微粒试剂是将抗异硫氯酸巧光素抗体与磁微粒偶联制得，通过抗异硫氯酸 巧光素抗体与异硫氯酸巧光素的特异性结合使抗原抗体免疫复合物固定在磁微粒上；
[001引所述的发光底物为ALPS。
[0014]进一步的，所述的抗试剂的制作方法为：
[001引1)、用缓冲液配置浓度为1.0~5. Omg/mL的异硫氯酸巧光素溶液；
[0016] 2)、将重组的丙型肝炎抗原和异硫氯酸巧光素溶液转移到栋色玻璃瓶中，室溫下 揽拌1~2小时；
[0017] 3)、使用pH 8~9的碳酸氨盐缓冲液进行平衡、洗脱纯化，得到异硫氯酸巧光素标 记的重组的丙型肝炎抗原；
[001引4)、用缓冲液配置浓度化.0~5. Omg/mL的碱性憐酸酶溶液；
[0019] 5)、将碱性憐酸酶溶液和重组的丙型肝炎抗原按照摩尔比为1:2~1:10的比例转 移到栋色玻璃瓶中，室溫下揽拌4-5小时；
[0020] 6)、使用pH 8~9的碳酸氨盐缓冲液进行平衡、洗脱纯化，碱性憐酸酶标记的重组 的丙型肝炎抗原；
[0021] 7)、将步骤3)得到的异硫氯酸巧光素标记的重组的丙型肝炎抗原和步骤6)得到的 碱性憐酸酶标记的重组的丙型肝炎抗原加入到含表面活性剂的Tris盐缓冲液中制得抗试 剂。进一步的，所述的表面活性剂为Tween 20、T;riton X-100、化onidox中的一种或多种，质 量浓度为0.01 %~0.5%。
[0022] 进一步的，所述的磁微粒试剂的制作方法为：
[0023] 1)、取充分混匀后的簇基磁珠浓缩液加入至反应瓶中，将反应瓶置于磁场中 15min，待簇基磁珠全部沉降后吸去上清；
[0024] 2)、向反应瓶中加入2~5倍于簇基磁珠体积的憐酸缓冲液，混匀20-30min;
[0025] 3)再次将反应瓶置于磁场中15min，待簇基磁珠全部沉降后吸去上清；
[0026] 4)、重复步骤2)和3)-次，然后用缓冲液将簇基磁珠定容到10~50mg/mL
[0027] 5)、向簇基磁珠溶液中加入抗异硫氯酸巧光素抗体，混匀状态、2~8°C下反应18小 时;其中簇基磁珠与抗异硫氯酸巧光素抗体的质量比为100:1;
[002引6)、使用憐酸缓冲液清洗3遍，定容至10mg/mL2~8°C保存待用。
[0029] 进一步的，所述发光底物为ALI^的制备方法为：
[0030] 1)、配置发光底物缓冲液;所述发光底物缓冲液中各成分的质量分数为:Ξ乙醇胺 2%，二乙醇胺0.75%，CTAB2%，N，N-二甲二叮呢硝酸盐0.3%，牛血清白蛋白0.15%， BronidoxO. 5%，用盐酸将发光底物缓冲液的抑调为9.5;
[0031 ] 2)、用4~10倍于ALI^体积的发光底物缓冲液充分溶解ALPS。
[0032] 进一步的，所述的含新生牛血清的缓冲液中添加有质量分数为0.01 %~0.05%的 防腐剂四环素、0.1 %~0.5%的硫酸新霉素、0.1 %~0.5%的proclin 300,添加防腐剂后 的新生牛血清的缓冲液用0.22WI1的滤膜过滤。
[0033] 进一步的，所述的化is盐缓冲液含化is盐0.1~0.5Mm/L、0.01 %~0.05 %质量分 数的四环素、1 %~5 %质量分数的绵羊血清、3 %~10 %质量分数的新生牛血清、1 %~5 % 质量分数的马血清，5%~10%质量分数的BSA、0.1%~0.5%质量分数的proclinSOO配制 而成。
[0034] 进一步的，试剂盒中还包括清洗液，所述清洗液为憐酸二氨钢、氯化纳、Tween20、 Proclin300的混合溶液。
[0035] -种定性检测丙型肝炎抗体的试剂盒的制备方法，其特征在于，分别配置定标液、 阴性对照品、阳性对照品、抗试剂、磁分离试剂和发光底物;将各试剂独立地置于包装容器 内。
[0036] 利用定性检测丙型肝炎抗体的试剂盒定性测定丙型肝炎抗体的方法，其特征在 于，包括W下几个步骤：
[0037] (1)取Ξ支试管分别加 SOliL定标液、阴性对照品、阳性对照品；
[0038] (2)向每一试管中加入30化抗试剂，用塑料薄膜覆盖试管，轻轻振荡试管30 s，置于 37°C下水浴15分钟；
[0039] (3)向每一试管中加入30化磁微粒试剂，用塑料薄膜覆盖试管，轻轻振荡试管30s， 置37°C下水浴5分钟；
[0040] (4)将试管在磁分离器上沉淀2分钟，确保每支试管都与分离器表面接触，缓慢的 倒转试管和磁分离器，倒出上清液;把倒转的试管连同磁分离器一起，放在滤纸上，拍击磁 分离器底部W除去粘在管壁上的所有液滴；
[0041] (5)每支试管中加入3(Κ)化清洗液，用塑料薄膜覆盖试管，轻轻振荡试管30s，混匀 后缓慢的倒转试管和磁分离器，倒出上清液，把倒转的试管连同磁分离器一起，放在滤纸 上，用力拍击分离器底部W除去粘在管壁上的所有液滴；
[0042] (6)重复步骤(5