用于检测猫杯状病毒IgG抗体的ELISA试剂盒及其检测方法
【专利摘要】用于检测猫杯状病毒IgG抗体的ELISA试剂盒及其检测方法，它涉及一种用于检测猫杯状病毒的试剂盒及其检测方法。它解决了目前猫杯状病毒诊断和检测结果不理想的问题。试剂盒包括ELISA微孔板、酶标二抗和底物显色液。方法：一、稀释加入ELISA微孔板孵育；二、加入酶标二抗孵育；三、加入底物显色液，室温避光反应；四、加入终止液终止反应，酶标仪检测450nm吸光值与ELISA试剂盒的Cut Off值进行比较，即得出检测结果。本发明ELISA试剂盒检测结果重复性稳定性高、速度快。
【专利说明】
用于检测猫杯状病毒I gG抗体的EL ISA试剂盒及其检测方法
技术领域
[0001 ]本发明涉及一种用于检测猫杯状病毒的试剂盒及其检测方法。
【背景技术】
[0002] 猫杯状病毒(Feline calicivirus，FCV)为杯状病毒科，水疮性病毒属，是一种单 链RNA病毒。FCV是猫病毒性呼吸道传染病主要表现为口腔溃疡、眼鼻分泌物增多、流涎、结 膜炎、羞明、口腔炎、气管炎、支气管炎，伴有双相热。是猫的多发病，发病率高，强毒株感染 可发生肺炎、呼吸困难、甚至死亡。主要传染源为病猫和带毒猫，病猫在急性期可随分泌物 和排泄物排出大量病毒，直接传染易感猫;带毒猫经治疗，症状可消失，临床康复后仍长期 排毒，是危险的传染源。
[0003] 根据病史、临床症状和流行特点进行诊断常常误诊，延误治疗并导致病毒的扩散 和传播。而目前猫杯状病毒抗体的检测使用的是血清中和试验和间接免疫荧光等方法，检 测耗时，重复性差、且多为实验室内部应用，缺少统一的标准。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是为了解决目前猫杯状病毒诊断和检测结果不理想，而提供的一种 用于检测猫杯状病毒IgG抗体的ELISA试剂盒及其检测方法。
[0005] 本发明用于检测猫杯状病毒IgG抗体的ELISA试剂盒包括ELISA微孔板、酶标二抗 和底物显色液;其中，ELISA微孔板内包含已包被的可溶性表达的猫杯状病毒0RF2重组蛋白 F〇
[0006] 其中，可溶性表达的FCV基因0RF2重组蛋白F的制备方法：
[0007] 根据Genbank中登录的猫杯状病毒(FCV)VPl基因序列(Genbank:X99445.1)设计扩 增猫杯状病毒0RF2的F区RNA片段的上游引物SacI:5'-ATT GAG CTC CTG GGT TAC ACA GGA AIT GGT-3'，和下游引物XholI:5'-ATA CTC GAG TCA TAA ITT TGT CAT ACT ACT-3'，并采 用PCR方法进行扩增，再将扩增的基因片段克隆到载体pET-32a中构建重组质粒，测序验证 无误后转入表达宿主菌E. coli BL21 (DE3)中用IPTG诱导表达，条件为：菌液于37°C摇床摇 至对数生长期(0D590nm值为0.4~0.6)加入IPTG至终浓度0.5mM，诱导温度为20°C，诱导时 间为7h，获得可溶性表达的猫杯状病毒0RF2重组蛋白F，猫杯状病毒0RF2重组蛋白F的氨基 酸序列为 VTLALLGYTGIGEQAIGSDRDRVVRISVLPETGARGGNHPIFYKNTIKLGYVIRSIDVFNS QILHTSRQLSLNHYLLPPDSFAVYRIIDSNGSWFDIGIDSDGFSFVGVSSLPTLEFPLSASYMGIQLAKIRLASNIR SSMTKL〇
[0008] ELISA微孔板的制备方法：
[0009] 用pH值为9.6的浓度为0.05mol/L的碳酸盐缓冲液作为包被缓冲液，将纯化后的猫 杯状病毒0RF2重组蛋白F稀释后，按lOOiil/孔加入微孔板，保证每孔中重组蛋白F的含量为 0.2yg; 4°C包被过夜，次日弃去包被液，再按100yl/孔加入浓度为5 %的脱脂乳封闭液，37 °C 静置2h，然后洗涤甩干、室温干燥后装入包装袋，加入干燥剂，真空保存。
[0010] lOOOmL 包被缓冲液由 1 ? 5g 的Na2C〇3、2 ? 9g 的 NaHC〇3加ddH2〇7K溶解，调节 pH 值至9 ? 6 后加余量的水制成。
[0011] 用上述ELISA试剂盒检测猫杯状病毒的方法：
[0012] 一、将待测血清用抗体稀释液按血清终点滴度稀释，然后按每孔lOOiil加入ELISA 微孔板，37 °C孵育lh，再用抗体稀释液清洗3~5次；
[0013] 二、每孔加入稀释的酶标二抗100yl，37°c孵育lh，再用抗体稀释液清洗3~5次；
[0014] 三、每孔加入底物显色液50yl，室温避光反应10~15min;
[0015] 四、每孔加入50yl终止液终止反应，酶标仪检测450nm吸光值与ELISA试剂盒的Cut Off值进行比较，即得出检测结果。
[0016] Cut Off值为阳性与阴性结果的临界值。
[0017]上述ELISA试剂盒的Cut Off值确立方法：以不同来源的猫杯状病毒阳性血清逐级 稀释作为一抗、以TOS缓冲液作为阴性对照，每个阳性血清稀释度检测N次;然后将与阴性对 照呈差异显著的最大稀释梯度作为血清终点滴度，不同来源的猫杯状病毒阳性血清的血清 终点滴度0D45Q?均值+3XSD为ELISA试剂盒的Cut Off值。
[0018] FCV基因组为单股正链RNA，大小约为7.81cb左右，其RNA5'端共价结合有VPg蛋白， FCV基因组包含三个0RF(0pen Reading Frame)，分别为0RF1、0RF2、0RF3 ARF2主要编码FCV 的衣壳蛋白，其翻译能够得到75KD的衣壳蛋白前体蛋白，前体蛋白经过病毒的蛋白酶切割 掉14kd的前导蛋白（IX)，得到成熟的62KD左右的成熟衣壳蛋白VPUFCV的衣壳蛋白根据不 同株之间的相似性可分为六个区域，主要分为A、B、C、D、E、F区。
[0019] 本发明所选猫杯状病毒检测抗原为0RF2的F区重组蛋白F，F区位于衣壳蛋白的高 度保守的羧基末端，位于病毒表面，为非中和抗体结合位点；因此0RF2重组蛋白F为猫杯状 病毒的结构蛋白之一，具有高抗原性，氨基酸保守性达89.0%~100 %，是抗原优势蛋白， 其特异性好、重复稳定性高。
[0020] 本发明采用间接E1ISA法检测猫杯状病毒，将0RF2重组蛋白F包被于ELISA微孔板 中，然后用5%的脱脂乳将酶标板封闭，加入待测样品。待测样品中的猫杯状病毒IgG抗体能 与酶标板中包被的0RF2重组蛋白F反应，形成F抗原-抗体复合物，酶标抗体加入后与之结 合，再通过底物显色液显色，终止液终止反应。利用酶标仪在450nm波长下测定吸光度值，0D 值的大小与待测样品中猫杯状病毒IgG抗体的含量成正比。
[0021]由于FCV感染率高，难以采集到足够的阴性血清样本，所以无法采用阴性血清样本 的0D45Qnm吸光值标定ELI SA判定标准。本发明中采用血清终点滴度法确立了本发明方法的 Cut Off值和判定标准，具有准确、可靠的优点。
[0022]本发明具有操作耗时时间短，快速的优点。免疫荧光检测对于荧光的强弱主观意 识过重，而本发明方法检测结果非主观判断，检测结论更为明确清晰。
【附图说明】
[0023] 图1是0RF2重组蛋白A、B、CD、E、F的间接ELI SA分析结果图。
[0024] 图2是实施例3中1号猫血清样本间接免疫荧光试验结果图。
[0025] 图3是实施例3中18号猫血清样本间接免疫荧光试验结果图。
[0026] 图4是实施例3中2号猫血清样本间接免疫荧光试验结果图。
【具体实施方式】
[0027]本发明技术方案不局限于以下所列举【具体实施方式】，还包括各【具体实施方式】间的 任意组合。
[0028]【具体实施方式】一：本实施方式用于检测猫杯状病毒IgG抗体的ELISA试剂盒包括 ELI SA微孔板、酶标二抗和底物显色液;其中，ELI SA微孔板内包含已包被的可溶性表达的猫 杯状病毒0RF2重组蛋白F。
[0029]本实施方式中可溶性表达的FCV基因0RF2重组蛋白F的制备方法：
[0030] 根据Genbank中登录的猫杯状病毒(FCV)VPl基因序列(Genbank:X99445.1)设计扩 增猫杯状病毒0RF2的F区RNA片段的引物，并采用PCR方法进行扩增，再将扩增的基因片段克 隆到载体pET-32a中构建重组质粒，测序验证无误后转入表达宿主E.coli BL21 (DE3)中用 IPTG诱导表达;然后优化截短蛋白表达的诱导条件一一具体如何操作、参数是多少，获得可 溶性表达的猫杯状病毒0RF2重组蛋白F。
[0031]本实施方式中ELISA微孔板的制备方法：
[0032]用pH值为9.6的浓度为0.05mol/L的碳酸盐缓冲液作为包被缓冲液，将纯化后的猫 杯状病毒0RF2重组蛋白F稀释后，按lOOixl/孔加入微孔板，保证每孔中重组蛋白F的含量为 0.2yg; 4°C包被过夜，次日弃去包被液，再按100yl/孔加入浓度为5 %的脱脂乳封闭液，37 °C 静置2h，然后洗涤甩干、室温干燥后装入包装袋，加入干燥剂，真空保存。
[0033] 1000mL包被缓冲液由1.5g的Na2C03、2.9g的NaHC0 3加ddH20水溶解，调节pH值至9.6 后加余量的水制成。
[0034]【具体实施方式】二:本实施方式与【具体实施方式】一的不同点是：用于检测猫杯状病 毒IgG抗体的ELISA试剂盒还包括终止液，终止液为硫酸溶液。其它步骤及参数与实施方式 一相同。
[0035]本实施方式中终止液为浓度是2mo 1 /L的硫酸溶液。
[0036]【具体实施方式】三:本实施方式与【具体实施方式】一或二的不同点是:底物显色液为 TMB显色液。其它步骤及参数与实施方式一或二相同。
[0037]【具体实施方式】四：本实施方式与【具体实施方式】一至三之一的不同点是:酶标二抗 为辣根过氧化物酶标记的山羊抗猫IgG。其它步骤及参数与实施方式一至三之一相同。 [0038]【具体实施方式】五:本实施方式与【具体实施方式】一至四之一的不同点是：用于检测 猫杯状病毒IgG抗体的ELISA试剂盒还包括抗体稀释液。其它步骤及参数与实施方式一至四 之一相同。
[0039] 本实施方式中抗体稀释液为pH值7.4的PBST，具体配置如下：1000ml溶液中含有液 0? 27g的KH2P〇4、3? 58g的Na2P〇4 ? 12H20、8? 0g的NaCI、0? 2g的KCL、0? 5ml的Tween-20和余量的 蒸馏水制成。
[0040]【具体实施方式】六:本实施方式用本发明ELISA试剂盒检测猫杯状病毒的方法：
[00411 一、将待测血清用抗体稀释液按血清终点滴度稀释，然后按每孔l00yl加入ELISA 微孔板，37 °C孵育lh，再用抗体稀释液清洗3~5次；
[0042] 二、每孔加入稀释的酶标二抗100y 1，37 °C孵育1 h，再用抗体稀释液清洗3~5次；
[0043] 三、每孔加入底物显色液50yl，室温避光反应10~15min;
[0044] 四、每孔加入50yl终止液终止反应，酶标仪检测450nm吸光值与ELISA试剂盒的Cut Off值进行比较，即得出检测结果。
[0045] 本实施方式步骤一设重复孔。酶标二抗为辣根过氧化物酶标记的山羊抗猫lgG，酶 标二抗稀释倍数为5000倍。终止液是浓度为2mol/L的硫酸溶液。底物显色液为TMB显色液。 ELI SA微孔板内包含已包被的可溶性表达的FCV基因0RF2重组蛋白F。
[0046] 本实施方式中ELISA试剂盒的Cut Off值为0.295。待测血清样本的0D值彡0.295， 则该样本为猫杯状病毒IgG抗体阴性;待测血清样本的0D值>0.295，则该样本为猫杯状病毒 IgG抗体阳性。
【具体实施方式】 [0047] 七:本实施方式与六的不同点是：以不同来源的猫杯 状病毒阳性血清逐级稀释作为一抗、以PBS缓冲液作为阴性对照，每个阳性血清稀释度检测 N次;然后将与阴性对照呈差异显著的最大稀释梯度作为步骤一的血清终点滴度。其它步骤 及参数与实施方式六相同。
[0048] 本实施方式中N>3。
【具体实施方式】 [0049] 八:本实施方式与七的不同点是:猫杯状病毒阳性血 清逐级稀释比例为 1:100、1:200、1:400、1:800，1:1600、1:3200、1:6400、1:12800、1: 21600 和1:51200。其它步骤及参数与实施方式七相同。
【具体实施方式】 [0050] 九：本实施方式ELISA试剂盒的Cut Off值确立方法：以不同来源的 猫杯状病毒阳性血清逐级稀释作为一抗、以PBS缓冲液作为阴性对照，每个阳性血清稀释度 检测N次;然后将与阴性对照呈差异显著的最大稀释梯度作为血清终点滴度，不同来源的猫 杯状病毒阳性血清的血清终点滴度0D4 5Qr?均值+3XSD为ELISA试剂盒的Cut Off值。
[0051] 本实施方式中N多3。本实施方式选用20份来源不同的猫杯状病毒阳性血清进行试 验。
[0052] 实施例1
[0053] 利用分子生物学软件对FCV 2280株（ATCC编号VR-2057，）VP1蛋白（GenBank: KC835209.1) A、B、⑶、E、F分区进行抗原性、可接近性、亲水性、主键柔韧性、抗原表位的定位 等方面的分析。
[0054] 软件DNAstar分析结果表明VP1蛋白的B区（125aa~397aa)、E区（426aa~524aa)、F 区（524aa~668aa)均具有较高的抗原性。
[0055] 软件Megalingn分析结果显示氨基酸保守性分别是B区为90.2%~100%4区为 67.7%~100%、F区为89.0%~100%。
[0056] 根据Genbank中登录的猫杯状病毒(FCV)VPl基因序列(Genbank:X99445.1)设计扩 增猫杯状病毒0RF2的A、B、CD、E、F区RNA片段的引物，并采用PCR方法进行扩增，再将扩增的 基因片段克隆到载体pET-32a中构建重组质粒，测序验证无误后转入表达宿主E.coli BL21 (DE3)中用IPTG诱导表达;然后优化截短蛋白表达的诱导条件。猫杯状病毒0RF2重组蛋白A、 CD诱导条件:菌液于37°C摇床摇至对数生长期，即0D590nm值为0.4~0.6之间，加入IPTG终 浓度为O.lmM，诱导温度为16°C，诱导时间为9h。猫杯状病毒0RF2重组蛋白B、E、F诱导条件： 菌液于37°C摇床摇至对数生长期，即0D590nm值为0.4~0.6之间，加入IPTG至终浓度为 0.5mM，诱导温度为20°C，诱导时间为7h。最终获得可溶性表达的分截断的猫杯状病毒0RF2 重组蛋白。
[0057] 利用Ni-NTA HIS Bind Resin对表达的重组蛋白进行纯化，并采用BCA法测定蛋白 浓度。纯化的0RF2重组蛋白等量上样(每孔11.7ug)，以猫杯状病毒质控阳性血清（1:500)作 为一抗，HRP标记的山羊抗猫IgG(l: 5000)作为二抗，进行Western blot分析，0RF2重组蛋白 B、E、F分别在相应蛋白大小处获得特异性蛋白条带，而0RF2重组蛋白A、CD在预期大小处蛋 白条带显色较浅，实验结果表明0RF2重组蛋白B、E、F具有良好的抗原性。用ImageJ软件测定 的0RF2重组蛋白A、B、CD、E、F的免疫印记灰度值分别为0、17123、0、18366、19471。统计学软 件分析结果表明0RF2重组蛋白B、E、F与重组蛋白A、⑶差异显著(P〈0.05)。以上结果与分子 生物学软件抗原性预测结果相符，可初步确定重组蛋白B、E、F为抗原优势蛋白。
[0058] 再以0RF2重组蛋白A、B、CD、E、F作为包被抗原，同浓度（2μg/ml)包板，每孔100yl， 以FCV阳性质控血清（1:12800稀释)作为一抗，以1:5000稀释的HRP标记的山羊抗猫IgG作为 二抗，并设阴性质控血清对照、空白对照。每孔均设两个平行对照，测定〇D45(U直。根据S/N值 大小判断重组蛋白18、〇)4、 17的抗原性强弱，8次重复操作后进行统计学检验。结果表明 0RF2重组蛋白F的0D 45QS/N值最高，与其它四个重组蛋白差异性显著(P〈0.05)(如图1所示）。 [0059] 结合生物信息学软件DNAstar及Western Blot抗原性分析结果，确定0RF2重组蛋 白F为FCV VP1优势抗原片段。
[0060]阳性质控血清:经疫苗免疫后猫血清再经56°C、30min补体灭活处理。
[0061]阴性质控血清:未患病且未经免疫的猫血清再经56°C、30min补体灭活处理。
[0062] 实施例2
[0063]取猫细小病毒、猫疱疹病毒、猫传染性鼻支气管炎病毒、猫传染性腹膜炎病毒和猫 杯状病毒共五份病毒阳性血清，用本发明检测猫杯状病毒IgG抗体的ELISA试剂盒进行检 测。只有猫杯状病毒阳性血清检测结果为阳性，其余四份血清样本均显示为阴性，实验证明 本发明检测猫杯状病毒IgG抗体的ELI SA试剂盒的特异性良好。
[0064]采用不同批次包被的ELISA微孔板进行操作，变异系数为0.05 %~0.26 %，小于 10%，证明本发明检测猫杯状病毒IgG抗体的ELISA试剂盒的批间重复稳定性高。
[0065]采用同一批次包被的ELISA微孔板进行操作，变异系数为0.01 %~0.06 %，小于 10%，证明本发明检测猫杯状病毒IgG抗体的ELISA试剂盒的批内重复稳定性高。
[0066] 实施例3
[0067]将20份来源不同的猫血清分别做间接ELISA实验(采用本发明试剂盒进行检测）、 中和试验及间接免疫荧光实验。
[0068] 实验结果如表1所示，间接ELISA实验的Cut Off值为0.295。
[0069]表1
[0071] 1号、18号和2号猫血清样本间接免疫荧光试验结果分别如图2、图3和图4所示。
[0072]采用本发明试剂盒的检测结果与中和试验检测结果的符合率为95%;与间接免疫 荧光试验检测结果的符合率为100 %。
【主权项】
1. 用于检测猫杯状病毒IgG抗体的ELISA试剂盒，其特征在于用于检测猫杯状病毒IgG 抗体的ELI SA试剂盒包括ELI SA微孔板、酶标二抗和底物显色液;其中，ELI SA微孔板内包含 已包被的可溶性表达的猫杯状病毒0RF2重组蛋白F。2. 根据权利要求1所述的用于检测猫杯状病毒IgG抗体的ELISA试剂盒，其特征在于用 于检测猫杯状病毒IgG抗体的ELISA试剂盒还包括终止液，终止液为硫酸溶液。3. 根据权利要求1或2所述的用于检测猫杯状病毒IgG抗体的ELISA试剂盒，其特征在于 底物显色液为TMB显色液。4. 根据权利要求3所述的用于检测猫杯状病毒IgG抗体的ELISA试剂盒，其特征在于酶 标二抗为辣根过氧化物酶标记的山羊抗猫IgG。5. 根据权利要求1或2所述的用于检测猫杯状病毒IgG抗体的ELISA试剂盒，其特征在于 用于检测猫杯状病毒IgG抗体的ELISA试剂盒还包括抗体稀释液。6. 用权利要求1所述ELISA试剂盒检测猫杯状病毒的方法，其特征在于检测方法按以下 步骤进行： 一、 将待测血清用抗体稀释液按血清终点滴度稀释，然后按每孔lOOyl加入ELISA微孔 板，37 °C孵育lh，再用抗体稀释液清洗3~5次； 二、 每孔加入稀释的酶标二抗1〇〇μ1，37Γ孵育lh，再用抗体稀释液清洗3~5次； 三、 每孔加入底物显色液50μ1，室温避光反应10~15min; 四、 每孔加入50μ1终止液终止反应，酶标仪检测450nm吸光值与ELISA试剂盒的Cut Off 值进行比较，即得出检测结果。7. 根据权利要求6所述的检测猫杯状病毒的方法，其特征在于以不同来源的猫杯状病 毒阳性血清逐级稀释作为一抗、以PBS缓冲液作为阴性对照，每个阳性血清稀释度检测N次； 然后将与阴性对照呈差异显著的最大稀释梯度作为步骤一的血清终点滴度。8. 根据权利要求7所述的检测猫杯状病毒的方法，其特征在于猫杯状病毒阳性血清逐 级稀释比例为 1:1〇〇、1:200、1:400、1:800,1:1600、1:3200、1:6400、1:12800、1:21600和 1: 51200。9. 权利要求1所述ELISA试剂盒的Cut Off值确立方法，其特征在于以不同来源的猫杯 状病毒阳性血清逐级稀释作为一抗、以PBS缓冲液作为阴性对照，每个阳性血清稀释度检测 N次;然后将与阴性对照呈差异显著的最大稀释梯度作为血清终点滴度，不同来源的猫杯状 病毒阳性血清的血清终点滴度〇D45Qr?均值+3XSD为ELISA试剂盒的Cut Off值。
【文档编号】G01N33/569GK106053801SQ201610382614
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年6月1日
【发明人】刘家森, 曲连东, 田进, 刘大飞, 刘春国, 郭东春, 李志杰, 刘明, 姜骞, 胡晓亮, 康洪涛, 吴红霞
【申请人】中国农业科学院哈尔滨兽医研究所