一种快速检测乳糜血的免疫层析试纸卡及其制备方法
【专利摘要】本发明涉及快速检测乳糜血免疫层析试纸卡及其制备方法，所述检测试纸卡由胶体金试纸条和卡槽组成，胶体金试纸条主要由支持板、NC膜、金标抗体垫、样品垫和吸水垫组成，所述的NC膜设置在支持板的中部，NC膜一侧的支持板上黏贴金标抗体垫和样品垫，NC膜的另一侧的支持板上黏贴有吸水垫，所述NC膜的中部有一条含有apoB的多克隆抗体的检测线和一条含有二抗的质控线，该试纸卡具有检测快速、准确度高、特异性强等优点，且不需要使用仪器设备，使用方便。本发明制备的乳糜血快速检测试纸卡，可在献血前快速对献血者进行乳糜血筛选，既能够极大程度上保护献血者提供的血液资源，也能够节约相关检测等费用。
【专利说明】一种快速检测乳糜血的免疫层析试纸卡及其制备方法
[0001]
技术领域
[0002]本发明属于临床血液学检测，尤其涉及快速检测乳糜血的胶体金试纸卡及制备方法。
【背景技术】
[0003]乳糜血或称脂血，餐后脂肪经过在小肠消化、吸收后，变成细小的乳糜微粒进入血液，乳糜微粒多到一定程度时，血清就由清澈透明的淡黄色液体变成乳白色的黏稠液体。血浆中因含有大量甘油三酯，而不能将其输给患者。甘油三酯是心血管疾病的独立危险因素。目前国内并没有针对街头采血时，用末梢血快速检测甘油三酯含量的办法。因此导致每年报废大量的脂血，造成血液资源的巨大浪费。
[0004]载脂蛋白(apolipoprotein，apo)是血楽脂蛋白中的蛋白质，其基本功能是运载脂类。
[0005]apoB由于氨基酸组成的差异，可分为以下亚类:apoB48和apoBlOCLapoIMS是乳糜微粒(CM)的载脂蛋白之一;apoBlOO是极低密度脂蛋白(VLDL)和低密度脂蛋白(LDL)的载脂蛋白之一。
[0006]载脂蛋白B-48(apoB-48)是唯一由小肠(人)分泌的脂蛋白，其与甘油三酯结合后生成乳糜微粒(chy1micronsCMs)及其残余物。CM中的apoB-48是结构蛋白，由apoBlOOmRNA特异编辑而得。ApoB48共有2153个氨基酸。其被中性脂酯化后，在甘油三酯转运蛋白(triglyceridetransferprotein(MTP))的协助下，生成初期的CM颗粒。未结合的apoB48立即降解。与肝分泌极低密度脂蛋白(VLDL)不同，在肠细胞中降解apoB48不是其主要的调控机制，在脂质缺乏的状态下，肠细胞分泌的apoB48是一种高密度脂蛋白。血清中apoB48的浓度可以代表CM及CM残留物的颗粒数。可利用apoB48追踪肠分泌CM的代谢过程。
[0007]目前普遍采用离心法检测乳糜血，但因使用离心机时，需要的动力及空间要求，只能在固定米血点使用，流动献血车无法使用该方法;米用尚心法时，需米集献血者2?3ml静脉血液进行筛选，大约需要10?15分钟的时间进行离心判断；离心法虽然检测结果准确，但是因其使用受限，不能使用其对乳糜血快速筛选。
[0008]ELISA、分子生物学实验技术适用于实验室使用，不适用于街头采血时使用。免疫层析胶体金技术是快速临床检测的最佳选择。胶体金检测乳糜血，不需要使用额外的设备，速度快，灵敏度高，特别适用于街头采血时，对献血者进行筛选。本发明属于国内首创，目前市场上并无针对乳糜血的快速检测用的免疫胶体金试纸条。
【发明内容】
[0009]本发明的目的是为解决在街头采血时，对献血者进行快速筛选，淘汰乳糜血献血者，节约宝贵的血液资源。
[0010]本发明为解决上述技术问题，采用的技术方案是:
本发明的第一个方面在于，一种快速检测乳糜血的免疫层析试纸卡，采用胶体金免疫层析法以及由胶体金免疫层析法衍生的所有方法，优选在胶体金免疫层析法中采用双抗体夹心法检测抗原。
[0011]所述的快速检测乳糜血的免疫胶体金试纸卡，包括胶体金试纸条和卡槽，该卡槽具有一个容置胶体金试纸条的内置空腔，且在该卡槽上设置有观察口和加样孔;该胶体金试纸条主要由支持板、NC膜(即硝酸纤维素膜)、金标抗体垫、样品垫和吸水垫组成，在该支持板的一侧从一端到另一端依次粘结样品垫、金标抗体垫、NC膜和吸水垫;在该NC膜的中部设有一条含有载脂蛋白多克隆抗体的检测线和一条含有二抗的质控线，该检测线与质控线间隔设置，并且检测线与金标抗体垫相邻;该胶体金试纸条设置在卡槽的内置空腔内，并使该观察口对应胶体金试纸条的检测线和质控线，加样孔对应样品垫。
[0012]所述金标抗体垫中金标抗体为鼠抗人载脂蛋白B48单克隆抗体，兔抗人载脂蛋白B48单克隆抗体中的至少一种等、优选鼠抗人载脂蛋白B48单克隆抗体；
检测线中的载脂蛋白B多克隆抗体包括兔抗人载脂蛋白B多克隆抗体、兔抗鼠载脂蛋白B多克隆抗体、羊抗人载脂蛋白B多克隆抗体、羊抗鼠载脂蛋白B多克隆抗体中至少一种，优选兔抗鼠载脂蛋白B多克隆抗体；
质控线中的二抗包括兔抗鼠I gG二抗、羊抗鼠I gG二抗、兔抗人I gG二抗、羊抗人I gG二抗中至少一种，优选兔抗鼠IgG 二抗；
本发明的第二个方面在于，快速检测乳糜血的免疫层析试纸卡的制备方法，包括以下步骤:
I)检测线的制备:采用喷金仪，用包被缓冲液稀释兔抗鼠载脂蛋白B多克隆抗体，在NC膜中检测线位置划线，即为检测线，晾干备用;所述的包被缓冲液为经过0.45μπι滤膜过滤的包被缓冲液，缓冲液可以是碳酸盐缓冲液，磷酸盐缓冲液，HEPES缓冲液，Tri s-HCl等中的至少一种，优选碳酸盐缓冲液，其浓度范围可以为0.0I?0.5Μ，优选0.05?0.1M，其pH值的范围为8.0?10.0，优选9.2?9.6;
质控线的制备:采用喷金仪，用包被缓冲液稀释兔抗鼠IgG 二抗，在NC膜上与检测线平行的位置划线，间隔3?7_，即为质控线，所述的包被缓冲液为经过0.45μπι滤膜过滤的包被缓冲液，缓冲液可以是碳酸盐缓冲液，磷酸盐缓冲液，HEPES缓冲液，Tr i s-HCl等中的至少一种，优选碳酸盐缓冲液，其浓度范围可以为0.0I?0.5M，优选0.05?0.1M，其pH值的范围为8.0?10.0，优选9.2?9.6;
其中，步骤(I)中检测线和质控线的线宽度为1mm，两线相距4mm，位于膜的中间，距NC膜的边距6?7mm;
NC膜组装制备:晾干检测线和质控线，得到含有检测线和质控线的NC膜;用封闭工作液将制备的NC膜于室温72h晾干，封存备用;所述的封闭工作液为2~4% BSA、2?4%脱脂奶粉和碳酸盐缓冲液混合，用0.45μπι滤膜过滤得到封闭工作液，其中碳酸盐缓冲液的浓度范围可为0.0I?0.5Μ，优选0.0I?0.1M，其pH值的范围为6.0?8.0，优选6.5~7.5。
[0013]2)制备涂覆金标抗体垫
用含1~3% BSA,0.1-0.2%叠氮钠，5?15%蔗糖，5?10%海藻糖，Tris-HCl缓冲液稀释金标的鼠抗人载脂蛋白B48单克隆抗体，将金标抗体溶液用喷金仪，均匀喷洒于玻璃纤维棉，56°C干燥Ih，加入干燥剂真空密封后，室温保存备用。
[0014]其中胶体金的制备方法:胶体金溶液的制备有许多种方法，其中最常用的是化学还原法，基本原理是向一定浓度的金溶液内加入一定量的还原剂使金离子变成金原子。目前常用的还原剂有:白磷、乙醇、过氧化氢、硼氢化钠、抗坏血酸、柠檬酸钠、鞣酸等。优选柠檬酸钠作为还原剂，用柠檬酸钠还原氯金酸，制备30?40nm的胶体金颗粒。
[0015]3)组装乳糜血快速检测试剂盒
将涂有检测线和质控线的NC膜黏贴在支持板的中部，在NC膜的一侧依次黏贴含有金标抗体的金标抗体垫以及样品垫，在NC膜的另一侧粘贴吸水垫，得到试纸板，将试纸板切割成不同宽度的试纸条，将试纸条安放于卡槽中，即为乳糜血快速检测试纸卡。
[0016]乳糜血快速检测试纸卡的应用及判定:对街头献血的献血者进行初筛时，采集献血者的末梢血液40yL，滴加于本试纸卡的加样孔中，在试纸卡的检测线、质控线位置均出现红色条带时，乳糜血检测为阳性;仅质控线出现一条红色条带时，为阴性结果;在试纸卡的质控线未出现红色条带时为无效结果。
[0017]本发明的有益效果:
乳糜血或称脂血，因血浆中含有大量甘油三酯，而不能将其输给患者。目前国内外并没有针对街头采血时，用末梢血快速检测乳糜血的办法。因此导致每年报废大量的乳糜血，造成血液资源的巨大浪费。
[0018]对于乳糜血的鉴定，通常采用离心的方法。采集2?3ml血液后，静止5分钟，然后3000g离心5?10分钟，可使血液分层，通过肉眼观察并鉴定血清层的清澈程度，判断血液是否为乳糜血。但该方法不适用于街头采血时，对献血者进行乳糜血筛选，原因如下:1.街头献血前筛选，一般采用末梢血进行检测，无法获得2?3ml血液样本;2.在流动献血车上，由于空间狭窄，动力不足，无法使用离心机;3.街头献血前筛选，一般要求在2分钟之内完成所有检测，离心法的时间过长。
[0019]针对上述情况，本发明为国内首创制备乳糜血快速检测试纸卡，该试纸卡具有检测快速、准确度高、特异性强等优点，且不需要使用其他仪器设备，使用方便。本发明制备的乳糜血快速检测试纸卡，可在献血前快速对献血者进行乳糜血筛选，使用40微升末梢血，能够在I分钟内对献血者进行乳糜血筛选，快速准确高效检测乳糜血，准确率达到98%以上，从而有效节约献血者的血液资源，极大程度上降低了血站的血液报废率，可将乳糜血的报废率从I?1.5%降低至O?0.1%，既能够保护献血者提供的血液资源，还能为血站节约相关的检测、储存、返回等费用。
[0020]
【附图说明】
[0021]图1为本发明胶体金试纸条的结构示意图图2是扣板式卡槽的立体结构示意图图3为使用本发明的胶体金试纸卡的检测结果示意图
附图标记说明:1、样品垫；2、金标抗体垫;3、NC膜(硝酸纤维素膜)；4、检测线、5、质控线;6、吸水垫;7、支持板;8、卡槽;9观察口； 10、加样孔;11、内置空腔。
[0022]
【具体实施方式】
[0023]下面结合具体实施例对本发明作进一步详细描述。
[0024]实施例1
参见图1和图2，本发明的一种快速检测乳糜血的免疫层析试纸卡，包括胶体金试纸条A和扣板式卡槽8，该扣板式卡槽8具有一个容置胶体金试纸条A的内置空腔11，且在该扣板式卡槽8上设置有观察口 9和加样孔10;该胶体金试纸条A主要由支持板7、NC膜3、金标抗体垫
2、样品垫I和吸水垫6组成，在该支持板7的一侧从一端到另一端依次粘结样品垫1、金标抗体垫2、NC膜3和吸水垫6;在该NC膜3的中部设有一条含有载脂蛋白B多克隆抗体的检测线4和一条含有IgG 二抗的质控线5，该检测线4与质控线5间隔设置，并且检测线4与金标抗体垫2相邻;该胶体金试纸条A设置在扣板式卡槽8的内置空腔11内，并使该观察口 9对应胶体金试纸条A的检测线4和质控线5(对应NC膜3的区域)，加样孔10对应胶体金试纸条的样品垫I。
所述金标抗体垫2中金标抗体为鼠抗人载脂蛋白B48单克隆抗体;所述NC膜3中检测线4的多抗为兔抗鼠载脂蛋白B多克隆抗体，质控线5的二抗为兔抗鼠I gG二抗。
[0025]实施例2
乳糜血快速检测试纸卡的制备方法，包括如下步骤:
I)制备NC膜3
检测线4的制备:采用喷金仪，用包被缓冲液稀释载体蛋白B多克隆抗体，在NC膜中检测线位置划线，即为检测线，晾干备用；所述的包被缓冲液为经过0.45μπι滤膜过滤的0.05ΜΡΗ9.6的碳酸盐缓冲液；
质控线5的制备:采用喷金仪，用包被缓冲液稀释兔抗鼠IgG 二抗，在NC膜上与检测线平行的位置划线，间隔5mm，即为质控线，所述的包被缓冲液为经过0.45μπι滤膜过滤的0.05ΜΡΗ9.6的碳酸盐缓冲液；
NC膜组装制备:晾干检测线和质控线，得到含有检测线和质控线的NC膜;用封闭工作液将制备的NC膜于室温72h晾干，封存备用；所述的封闭工作液为2.5%BSA、2%脱脂奶粉和
0.01M，pH7.0的碳酸盐缓冲液混合后用0.45μπι滤膜过滤得到封闭工作液。
[0026]2)制备涂覆金标抗体垫2
用含1.5%BSA、0.1%叠氮钠，8%蔗糖，5%海藻糖，0.5MTris_HCl，pH8.5的稀释缓冲液稀释金标的载脂蛋白B的单抗;将金标抗体溶液用喷金仪，均匀喷洒于玻璃纤维棉，56 °C干燥Ih，加入干燥剂真空密封后，室温保存备用。
[0027]3)组装乳糜血快速检测试纸卡
将涂有检测线和质控线的NC膜黏贴在支持板的中部，在NC膜的一侧依次黏贴金标抗体垫和样品垫，在NC膜的另一侧粘贴吸收垫，得到试纸板，将试纸板切割成不同宽度的试纸条，将试纸条安放于卡槽中，即为乳糜血快速检测试纸卡。
[0028]实施例3
按照实施例1及实施例2的方法制备乳糜血快速检测试纸卡后，按照下述方法使用。
[0029]I)乳糜血快速检测试纸卡的使用及判定
对街头献血的献血者进行初筛时，采集献血者的末端血液40微升，滴加于本试纸卡的样品垫I上(图1中箭头B处)，滴加血液后，血清将按图1中箭头C所指方向进行虹吸前进，血清中的apoB48首先会与金标垫2上的标记有胶体金的apoB48单克隆抗体特异结合，并随血清向前运动，当到达检测线4位置时，apoB48会被固定于检测线4的apoB48多克隆抗体所捕获，当有足够多的apoB48被捕获时，其上连接的胶体金因聚集而显红色。未结合apoB48的标记有胶体金的apoB48单克隆抗体会继续向前运动直至质控线5，在质控线5上固定有IgG 二抗，二抗将捕获所有的未结合apoB48的标记有胶体金的apoB48单克隆抗体，并显红色。
[0030]在试纸卡的检测线4、质控线5位置均出现红色条带时，乳糜血检测为阳性(如图3b);仅质控线5出现一条红色条带时，为阴性结果(如图3a);在试纸卡的质控线5未出现红色条带时为无效结果(如图3c和图3d)。
[0031]2)在街头采血车上的实际应用
已在国内某省级血液中心的四台流动采血车，两个固定采血点，分别进行为期一个月的乳糜血筛选。一台采血车或一个采血点，一个月可采集大约2000名献血者的血液，其中大约20~30名献血者为乳糜血，报废率为I?1.5%。
[0032]在使用胶体金试纸卡筛选乳糜血的一个月内，4台流动采血车分别采集2名、I名、O名、I名乳糜血献血者，报废率分别为0.1%、0.05%、0、0.05%。数据表明，选用该试纸卡筛选乳糜血后，可将血液报废率从I?1.5%降低至O?0.1%，节约大量血液资源。
[0033]在两个固定采血点上，用离心法与胶体金法进行比对分析。两个采血点，一个月之内，共采集4057名献血者。在4057名献血者中，采用离心法作为对照，检测出乳糜血献血者为47名，其中3名为轻度乳糜血献血者；胶体金快速检测试纸卡法检测乳糜血献血者为44名，准确率为99.9%。
[0034]本发明的胶体金试纸卡法筛选乳糜血，不受场地及设备的限制，采用末梢血，在I分钟内完成乳糜血的筛选。通过使用本发明的胶体金试纸条，大大降低了乳糜血的报废率，极大的节约了血液资源。
[0035]上述实施例仅为说明本发明的技术构思及特点，并不能以此限制本发明的保护范围，凡根据本发明精神实质所作的修改和变化，均涵盖在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1.一种快速检测乳糜血的免疫层析试纸卡，其特征在于，检测乳糜血的靶点是载脂蛋白B。2.根据权利要求1的一种快速检测乳糜血的免疫层析试纸卡，其特征在于，检测乳糜血的靶点是载脂蛋白B48。3.根据权利要求1或2所述的一种检测乳糜血的免疫层析试纸卡，其特征在于，采用胶体金免疫层析法以及由胶体金免疫层析法衍生的所有方法。4.根据权利要求3所述的一种检测乳糜血的免疫层析试纸卡，其特征在于，所述的胶体金免疫层析法中采用双抗体夹心法。5.根据权利要求3所述的一种快速检测乳糜血的免疫层析试纸卡，其特征在于， 包括胶体金试纸条和卡槽，该卡槽具有一个容置胶体金试纸条的内置空腔，且在该卡槽上设置有观察口和加样孔;该胶体金试纸条主要由支持板、NC膜、金标抗体垫、样品垫和吸水垫组成，在该支持板的一侧从一端到另一端依次粘结样品垫、金标抗体垫、NC膜和吸水垫;在该NC膜的中部设有一条用载脂蛋白多克隆抗体画出的检测线和一条用二抗画出的质控线，该检测线与质控线间隔设置，并且检测线与金标抗体垫相邻;该胶体金试纸条设置在卡槽的内置空腔内，并使该观察口对应胶体金试纸条的检测线和质控线，加样孔对应样品垫。6.一种根据权利要求5所述的快速检测乳糜血的免疫胶体金试纸卡，其特征在于， 所述检测线的制备方法包括以下步骤:采用喷金仪，用包被缓冲液稀释兔抗鼠载脂蛋白B多克隆抗体，在NC膜中检测线位置划线，即为检测线，晾干备用;所述的包被缓冲液为经过0.45μηι滤膜过滤的包被缓冲液，包被缓冲液包括碳酸盐缓冲液，磷酸盐缓冲液，HEPES缓冲液，Tris-HCl中至少一种，包被缓冲液浓度范围为0.0l?0.5Μ，pH值范围为8.0-10.0,包被缓冲液优选为碳酸盐缓冲液，包被缓冲液优选浓度范围为0.05?0.1M，pH值范围优选为9.1?9.6； 所述质控线的制备方法包括以下步骤:采用喷金仪，用包被缓冲液稀释兔抗鼠IgG二抗，在NC膜上与检测线平行的位置划线，间隔3~7mm，即为质控线，所述的包被缓冲液为经过0.45μηι滤膜过滤的包被缓冲液，包被缓冲液包括碳酸盐缓冲液，磷酸盐缓冲液，HEPES缓冲液，Tris-HCl中至少一种，浓度范围为0.01?0.5Μ，ρΗ值范围为8.(M0.0，包被缓冲液优选为碳酸盐缓冲液，包被缓冲液优选浓度范围为0.05-0.1M，pH值范围优选为9.2-9.6； 其中，所述检测线和质控线的线宽度为1mm，两线相距4mm，位于膜的中间，距NC膜的边距6?7mm; 所述NC膜的制备方法包括以下步骤:晾干检测线和质控线，得到含有检测线和质控线的NC膜;其中晾干用封闭工作液将制备的NC膜于室温72h，封存备用;所述的封闭工作液为2-4%BSA、2?4%脱脂奶粉和碳酸盐缓冲液混合，用0.45μπι滤膜过滤得到封闭工作液，其中碳酸盐缓冲液的浓度范围为0.01-0.5Μ，pH值范围为6.0-8.0，碳酸盐缓冲液的浓度范围优选为0.01?0.1Μ，ρΗ值的范围优选为6.5?7.5; 所述金标抗体垫的制备方法包括以下步骤:用含1.5%BSA、0.1%叠氮钠，8%蔗糖，5%海藻糖，0.5M Tris-HCl，pH8.5的稀释缓冲液稀释金标的载脂蛋白B的单抗;将金标抗体溶液用喷金仪，均匀喷洒于玻璃纤维棉，56°C干燥Ih，加入干燥剂真空密封后，室温保存备用。7.根据权利要求4所述的快速检测乳糜血的免疫层析试纸卡，其特征在于，所述胶体金的制备方法为化学还原法，其中还原剂包括白磷、乙醇、过氧化氢、硼氢化钠、抗坏血酸、柠檬酸钠、鞣酸，优选用还原剂柠檬酸钠还原氯金酸，制备30?40nm的胶体金颗粒。8.根据权利要求6所述的一种快速检测乳糜血的免疫层析试纸卡，其特征在于， 所述检测线中的载脂蛋白B多克隆抗体包括兔抗人载脂蛋白B多克隆抗体、兔抗鼠载脂蛋白B多克隆抗体、羊抗人载脂蛋白B多克隆抗体、羊抗鼠载脂蛋白B多克隆抗体中至少一种，优选为兔抗鼠载脂蛋白B多克隆抗体； 所述质控线中的二抗包括兔抗鼠I gG 二抗、羊抗鼠I gG 二抗、兔抗人I gG 二抗、羊抗人I gG二抗中至少一种，优选质控线的二抗为兔抗鼠IgG 二抗； 所述金标垫中的金标抗体为载脂蛋白B48单克隆抗体，包括鼠抗人载脂蛋白B48单克隆抗体，兔抗人载脂蛋白B48单克隆抗体中至少一种，优选鼠抗人载脂蛋白B48单克隆抗体。
【文档编号】G01N33/558GK106053793SQ201610442671
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年6月20日
【发明人】王成, 刘建强
【申请人】诺莱生物医学研究院（北京）有限公司