吉他霉素的免疫胶体金检测卡及其制备方法与流程

本发明可有效用于测定抗生素吉他霉素，方法简单，方便，快捷，结果准确。
背景技术：
：吉他霉素(kitasamycin)又称柱晶白霉素,是由北里链霉菌(Streptomyceskitasatoensis)产生的一种多组分大环内酯类抗生素,含有A1、A3、A4、A5等9种A族和4种B族组分。对多数革兰氏阳性菌和部分革兰氏阴性菌及霉形体均有较强抗菌活性[3],用于防治畜禽细菌感染和霉形体病等以及用作促生长剂。吉他霉素具有强苦味,能影响动物适口性且对胃有刺激作用,其碱性特点使其在胃酸性环境时(pH≤5.5)降解而活性降低,为避免以上缺点已成功研制吉他霉素微囊制剂(肠溶材料包被)。但其在动物源性食品中的残留给人类健康带来极大隐患。因此，残留检测刻不容缓。技术实现要素：针对以上情况，本发明的目的就是为了克服现有技术的缺陷，而提供一种吉他霉素的免疫胶体金检测卡及其制备方法，可有效解决能快速有效的检测出抗生素吉他霉素的问题。本发明的吉他霉素的胶体金的检测卡包括单克隆抗体胶体金标记物的胶体金结合垫、包被了吉他霉素-BSA和羊抗鼠IgG的硝酸纤维素膜、样品垫、吸水垫，中间黏贴硝酸纤维素膜，另一端粘附吸水垫。本发明的吉他霉素胶体金检测卡的制备方法由以下步骤实现：（1）胶体金溶液制备：取1L三角烧瓶2个，加入超纯水495mL，而后加入1%氯金酸5ml，制成500ml0.01%氯金酸水溶液，加热煮沸后在持续搅拌的情况下加入1%柠檬酸三钠溶液5-7ml，继续搅拌加热，当溶液的颜色完全变为透明的紫红色时，维持5min后停止加热，补水至原体积，冷却至室温，2-8℃保存备用；（2）抗体的预处理：将要标记的吉他霉素抗体在1000r/min，4℃条件下，离心20min，取上清，用0.01mol/LPBS稀释成lmg/ml；或者0.01mol/L,PBS稀释成lmg/ml，过0.22um滤膜；（3）胶体金标记物的制备：取步骤（1）中的胶体溶液40mL，用0.25mol／LK2C03,，调节胶体金溶液PH至8.5，电磁搅拌器250r／min搅拌。逐滴加入4ml含0.3mg抗体蛋白的蛋白溶液。反应10min；逐滴加入4mLl0％BSA，继续搅拌反应10min；金标抗体溶液常温1500r/min离心10min，弃去由凝聚的金颗粒形成的沉淀；红色上清溶液4℃，12000r/min离心20min，弃上清，收集沉淀定，将沉淀用金标抗体稀释液定容至1mL，制备成吉他霉素单克隆抗体胶体金标记物：（4）胶体金膜的制备：将步骤（3）吉他霉素单克隆抗土胶体金标记物用划膜仪以5/cm的浓度均匀喷在载体玻璃纤维膜上，室温自然晾干或者37℃烘干3h，制成含吉他霉素单克隆抗土胶体金标记物的胶体金膜；（5）包被膜制备：将羊抗鼠IgG抗体吉他霉素蛋白质偶联物稀释成1mg/mL,用划膜仪依次以1/cm的浓度喷涂在硝酸纤维膜上，制备成包被膜，37℃包被2h后，室温自然晾干或者37℃烘干；（6）样品垫前处理；将样品垫前处理液均匀涂布在玻璃纤维素膜上，在空气湿度低于60%的条件下，室温自然晾干；（7）检测卡的组装：PVC胶板自上而下依次粘贴样品垫，胶体金膜，包被膜和吸水垫，组装成试纸条，切割成一定宽度的长条，再将试纸条安装在长条扁平壳状的检测卡外壳中。所述的吉他霉素胶体金检测卡，起特征在于所述步骤（5）中所包被的检测线T设在质控线C的下方。所述步骤（6）中样品垫处理液是由1g小牛血清（BSA）和0.8g氯化钠（NaCl）,用含有0.5%TRITON-100的0.01mol/LPBS定容至100mL。附图说明图1为本发明吉他霉素的免疫胶体金检测卡的结构图：图1.加样孔2.检测线3.质控线4.检测孔5.试纸条6.检测卡外壳；图2为发明吉他霉素的免疫胶体金检测卡内的试纸条的剖视结构图，图中7.样品垫8.胶体金结合垫9.PVC胶体10.硝酸纤维素膜11.吸水垫。具体实施方式实施例1图1为本发明吉他霉素的免疫胶体金检测卡的结构图，图2为本发明吉他霉素的免疫胶体金检测卡内的试纸条剖视结构图：图中9为PVC胶板；7为样品垫；8为胶体金结合垫，该胶体金结合垫上包被了单克隆抗土胶体金标记物；10为包被膜，即硝酸纤维素膜，该硝酸纤维膜上包被了吉他霉素-BSA和羊抗鼠IgG；11为吸水垫，由吸水材料如滤纸制成。在PVC胶板9的另一端上（样品端）粘附样品垫7、胶体金结合垫8，样品垫7和胶体金结合垫8为并排结构。在PVC胶体9的中间粘附硝酸纤维素膜10在硝酸纤维素膜上设置有羊抗鼠IgG质控线3和吉他霉素-BSA检测线2。在PVC胶板9的另一端粘附吸水垫11。硝酸纤维索膜10的一端与结合垫8略交叉，另一端与吸水垫11略交叉。该试纸条5可装入有塑料模具制成的检测卡外壳6中，在检测卡外壳6的上盖设有加样孔1和检测孔4，样品垫7正对加样孔1，硝酸纤维素膜10正对检测孔4。实例2吉他霉素胶体金检测卡制备，是由以下步骤具体实现：（1）胶休金溶液制备：取1L三角烧瓶1个，加入超纯水495mL，而后加入1％氯金酸5mL，配制成500mL0.01％氯金酸水溶液，加热煮沸后在持续搅拌的情况下加入1％柠檬酸三钠(Na3C6H5O7·2H2O)溶液5-7mL，继续搅拌加热，当溶液的颜色完全变为透明的紫红色时，维持5min后停止加热，补水至原体积，冷却至室温，2-8℃保存备用；（2）抗体的预处理：将要标记的吉他霉素抗体在1000r/min，4℃条件下，离心20min,取上清，用0.01mol/LPBS稀释成1mg/mL；或者用0.0lmol/LPBS稀释成1mg/mL，过0.22um滤膜；（3）胶体金标记物的制备：取步骤(1)中的胶体金溶液40mL，用0.25mol/LK2C03,调节胶体会溶液PH至8.5，电磁搅拌器250r／min搅拌，逐滴加入4mL含0.3mg抗体蛋白的蛋白溶液，反应10min：逐滴加入4mL10％BSA，继续搅拌反应10min：金标抗体溶液常温低速（1500r/min）离心10min，弃去由凝聚的金颗粒形成的沉淀：红色上清溶液4℃，12000r/min离心20min，弃上清，收集沉淀，将沉淀用金标抗体稀释液定容至1mL，制备成吉他霉素单克降抗体胶体金标记物；（4）胶体金膜的制备：将步骤(3)吉他霉素单克降抗体胶体会标记物用划膜仪以5μL／cm浓度均匀喷在载体玻璃纤维素膜上，室温自然晾干或37℃烘干3h，制成含吉他霉素克隆抗体胶体金标记物的胶体金膜：（5）包被膜制备：将羊抗鼠IgG抗体、吉他霉素蛋白质偶联物稀释成1mg/ml，用划膜仪依次以1μL／cm的浓度喷涂在硝酸纤维素膜上，制备成包被膜，37℃包被2h后，室温自然晾干或37℃烘干；（6）样品垫前处理：将样品垫处理液均匀涂布在玻璃纤维素膜上，在空气湿度低于60％的条件下，室温自然晾干；（7）检测卡的组装：PVC胶板自上而下依次粘贴样品垫、胶体金膜、包被膜和吸水棉，组装成试纸条，切割成一定宽度长条，再将试纸条安装在长条扁平壳状的检测卡外壳中。实施例3吉他霉素最低检出限量试验准确称量0.500g吉他霉素标准品溶于超纯水并定容至100mL，标为A1溶液，取上A1溶液lmL于容量瓶加超纯水并定容至1000mL，形成A2溶液，取A2溶液1mL于容量瓶加超纯水定容至1000mL，形成A3溶液，则A3溶液的浓度为5ng/mL(5ppb)。取A3溶液1mL于4支试管中，并分别标号1~4，往试管中分别加入往9mL、4mL、1ml、0ml，超纯水，配成A吉他霉素标准品溶液溶度分别是：0.5ng/mL.1ng/mL.2.5ng/mL、5ng/mL；另取一支空试管，加入5mL超纯水，标为5号试管。取上述1~5号试管中液体作为样品滴加到吉他霉素检测卡上，加样后5min观察结果，检测线2和质控线3的显色结果见表1。表1吉他霉素最低检出限量试验试管编号吉他霉素溶液浓度（ng/mL）测定结果10.5检测线T显色比质控线C略淡21检测线T显色稍淡32.5检测线T显色较淡35检测线T不显色50检测线T与质控线显色基本相同经多次检验，吉他霉素的检出率达99%，最低检出限量为5ng/mL。当前第1页1 2 3