肺炎支原体抗体免疫胶体金检测试纸条及其制备方法

肺炎支原体抗体免疫胶体金检测试纸条及其制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种肺炎支原体抗体免疫胶体金检测试纸条及其制备方法，是将肺炎支原体抗原及胶体金标记肺炎支原体抗原，分别固定在硝酸纤维素膜和玻璃纤维素膜上，组成肺炎支原体抗体双抗原夹心法免疫胶体金检测试纸条。试纸条由样品垫、包被有胶体金标记肺炎支原体抗原胶体金垫、包被肺炎支原体抗原硝酸纤维素膜及PVC底板4个部分组成，样品垫用玻璃纤维素膜。在PVC底板中央贴上包被好的硝酸纤维素膜，以纯化肺炎支原体抗原在硝酸纤维素膜上划线作为测试线，以抗肺炎支原体单克隆抗体在硝酸纤维素膜上划线作为控制线。检测时取抗凝血或血清1滴，滴加在样品垫上，根据测试线和控制线是否出现色带来判断血清中是否存在肺炎支原体抗体。本发明建立了敏感快速的检测血清中肺炎支原体抗体的方法，主要供肺炎支原体流行病学调查使用。
【专利说明】
肺炎支原体抗体免疫胶体金检测试纸条及其制备方法
技术领域
[0001] 本发明设及肺炎支原体抗体的检测，具体是一种肺炎支原体抗体双抗原夹屯、法免 疫胶体金检测试纸条及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 肺炎支原体(M. Pneumonia)是人类支原体肺炎的病原体。支原体肺炎的病理改变 W间质性肺炎为主，有时并发支气管肺炎，称为原发性非典型性肺炎。主要经飞沫传染，潜 伏期2~3周，发病率W青少年最高。临床症状较轻，甚至根本无症状，若有也只是头痛、咽 痛、发热、咳嗽等一般的呼吸道症状，但也有个别死亡报道。一年四季均可发生，但多在秋冬 时节。
[0003] 自肺炎支原体疫苗研制成功W后，极大地减少了儿童的发病率。然而，确定人群流 行病学情况需要进行抗体的动态观察。因此研制肺炎支原体抗体检测试剂盒是客观急需 的。胶体金免疫层析试纸条法因其检测时不需要特殊设备，结果出现快速、方法简便易掌 握，可实现现场快速检测等特点，已成为目前传染病快速检测的研究热点。本试剂条的技术 特殊之处是采用了双抗原夹屯、法，大大降低了非特异性反应，提高了对抗体检测的特异性 和灵敏度。该检测结果与德国VIRI0N/SERI0N公司肺炎支原体IgG抗体检测试剂盒一致率高 达 96.5%。

【发明内容】

[0004] 本发明提供了一种肺炎支原体抗体双抗原夹屯、法免疫胶体金检测试纸条及其制 备方法。
[0005] 本发明的技术方案为：
[0006] 肺炎支原体抗体双抗原夹屯、法免疫胶体金检测试纸条的制备方法，其特征在于： 包括W下步骤：
[0007] (1)包被有肺炎支原体抗原的胶体金垫的制备:采用巧樣酸Ξ钢还原法，制备30皿 的胶体金。用0.2mol/L Κ2〇)3将胶体金溶液调到抑8.0。然后将溶液置于磁力揽拌器上缓慢 揽拌，按每100ml溶液加入Img肺炎支原体抗原将蛋白缓慢滴加到胶体金溶液中，继续揽拌 2h，再滴加入到终浓度为0.1 %的PEG3000、1 %薦糖和1 %的酪蛋白进行封闭60min，标记结 束后W 120(K)r/m离屯、，弃上清，沉淀物用0.Olmol/L PBS溶液重悬，将沉淀重悬为原体积的 1/10,再经2000r/min离屯、20min，取上清加至葡聚糖凝胶层析柱纯化，最终纯度达95%W 上。然后将标记胶体金溶液加样于玻璃纤维素膜上，在溫度20°C~25°C干燥地，制成胶体金 垫，干燥备用。
[000引（2)肺炎支原体抗原包被硝酸纤维素膜：用生理盐水将肺炎支原体抗原稀释成 Img/ml，然后用喷膜仪将肺炎支原体抗原在硝酸纤维素膜上按1.化1/cm进行划线包被，同 时在硝酸纤维素膜上按1.化1/cm包被鼠抗肺炎支原体单克隆抗体，用于产品的质控线，包 被完成后将硝酸纤维素膜在干燥间室溫干燥化，备用。
[0009] (3)试纸条的组装:在干燥间内准备好吸水滤纸、样品垫、PVC底板，在PVC底板中央 贴上包被好的肺炎支原体抗原硝酸纤维素膜，硝酸纤维素膜上缘粘贴吸水滤纸，硝酸纤维 素膜下缘粘贴包被肺炎支原体抗原胶体金垫，胶体金垫下缘粘贴样品垫，完成后用裁切机 将贴好的试纸板切成5mm宽的试纸条。再将试纸条密封于侣锥袋中，完成产品的组装。
[0010] 本发明试剂盒的检测结果与德国VIRI0N/SERI0N公司肺炎支原体IgG抗体检测试 剂盒一致率高达96.5 %，表明本发明试剂盒灵敏度和特异性高。
【具体实施方式】
[0011] (1)本发明检测试纸条结构如下
[0012] 在PVC底板中央贴上包被好的肺炎支原体抗原硝酸纤维素膜，硝酸纤维素膜上缘 粘贴吸水滤纸，硝酸纤维素膜下缘粘贴包被肺炎支原体抗原胶体金垫，胶体金垫下缘粘贴 样品垫，完成后用裁切机将贴好的试纸板切成5mm宽的试纸条。
[0013] (2)肺炎支原体抗体双抗原夹屯、法免疫胶体金检测试纸条生产工艺
[0014] 肺炎支原体纯化膜蛋白抗原的胶体金标记:采用巧樣酸Ξ钢还原法，制备30nm的 胶体金。用0.2mol/L Κ2〇)3将胶体金溶液调到抑8.0。然后将溶液置于磁力揽拌器上缓慢揽 拌，按每100ml溶液加入Img肺炎支原体抗原(购自Abeam公司，货号ab 124007)将蛋白缓慢滴 加到胶体金溶液中，继续揽拌化，再滴加入到终浓度为0.1 %的PEG3000、1 %薦糖和1 %的酪 蛋白进行封闭60min，标记结束后W1200化/m离屯、，弃上清，沉淀物用O.Olmol/L PBS溶液重 悬，将沉淀重悬为原体积的1/10，再经2000r/min离屯、20min，取上清加至葡聚糖凝胶层析柱 纯化，最终纯度达95 % W上。然后将标记胶体金溶液加样于玻璃纤维素膜上，在溫度2(TC~ 25 °C干燥4h，制成胶体金垫，干燥备用。
[0015] 肺炎支原体抗原包被硝酸纤维素膜：用生理盐水将肺炎支原体抗原（购自 Meridian Life Science公司，货号3肥1715)稀释成Img/ml，然后用喷膜仪将肺炎支原体抗 原在硝酸纤维素膜上按1.化1/cm进行划线包被，同时在硝酸纤维素膜上按1.化1/cm包被鼠 抗肺炎支原体单克隆抗体，用于产品的质控线，包被完成后将硝酸纤维素膜在干燥间室溫 干燥化，备用。
[0016] 试纸条的组装:在干燥间内准备好吸水滤纸、样品垫、PVC底板，在PVC底板中央贴 上包被好的肺炎支原体抗原硝酸纤维素膜，硝酸纤维素膜上缘粘贴吸水滤纸，硝酸纤维素 膜下缘粘贴包被肺炎支原体抗原胶体金垫，胶体金垫下缘粘贴样品垫，完成后用裁切机将 贴好的试纸板切成5mm宽的试纸条。再将试纸条密封于侣锥袋中，完成产品的组装。
[0017] (3)利用上述试纸条检现恤清中肺炎支原体抗体：
[0018] 取下单人份检测条包装，抓住未密封的一端，撕开侣泊包装，尽快检测。
[0019] 将检测条水平放置，准确滴加1滴(约50μ1)血清或血浆样本在试纸条的样品垫。
[0020] 5分钟内读取结果。
[0021] 结果判断：
[0022] 阳性:控制线出现红色条带，测试线出现红色条带，为肺炎支原体抗体阳性；
[0023] 阴性:控制线出现红色条带，测试线不出现红色条带，为肺炎支原体抗体阴性。
[0024] 失效:控制线不出现红色条带，或控制线、测试线均不出现红色条带，为试剂条失 效。
[0025] (4)肺炎支原体抗体检测试纸条特异性试验：
[0026] W肺炎支原体标准IgG阳性血清、衣原体标准IgG阳性血清、腺病毒标准IgG阳性血 清、呼吸道合胞病毒病毒标准IgG阳性血清和肺炎支原体标准IgG阴性血清采用肺炎支原体 抗体免疫胶体金检测试纸条检测，只有肺炎支原体标准IgG阳性血清检测结果为阳性，其它 均为阴性，说明该试剂条特异性良好。
[0027] (5)肺炎支原体抗体免疫胶体金检测试纸条重复性试验：
[00%]随机抽取20份肺炎支原体标准IgG阳性血清、阴性血清分别于不同的时间进行重 复检测，变异系数均巧％，证明该试剂盒具有良好的稳定性和重复性。
[0029] (6)肺炎支原体抗体免疫胶体金检测试纸条临床标本检测：
[0030] 试纸条与德国VIRI0N/SERI0N公司试剂盒肺炎支原体IgG抗体检测试剂盒的比较：
[0031] 对228份标本用两种试剂盒检测比较阴性与阳结果，如表1所示：
[0032] 表1与VIRI0N/SERI0N试剂盒的比较结果
[0033]
[0034] 对228份标本用两种试剂盒检测共有220例相符(96.5 % )，有8例不符(3.5 % )，运 种差别不符，估计可能是与两种试剂盒原理不同有关，德国VIRI0N/SERI0N公司试剂盒是 ELISA法，我们的试剂盒是胶体金免疫层析法。
【主权项】
1.肺炎支原体抗体免疫胶体金检测试纸条的制备方法，其特征在于:包括以下步骤： (1) 包被有肺炎支原体抗原的胶体金垫的制备:采用柠檬酸三钠还原法，制备30nm的胶 体金。用0.2mol/L K2C03将胶体金溶液调到pH8.0。然后将溶液置于磁力搅拌器上缓慢搅拌， 按每100ml溶液加入lmg肺炎支原体抗原将蛋白缓慢滴加到胶体金溶液中，继续搅拌2h，再 滴加入到终浓度为0.1 %的PEG3000、1 %蔗糖和1 %的酪蛋白进行封闭60min，标记结束后以 12000r/m离心，弃上清，沉淀物用0.0 lmol/L PBS溶液重悬，将沉淀重悬为原体积的1/10，再 经2000r/min离心20min，取上清加至葡聚糖凝胶层析柱纯化，最终纯度达95%以上。然后将 标记胶体金溶液加样于玻璃纤维素膜上，在温度20°C~25°C干燥4h，制成胶体金垫，干燥备 用。 (2) 肺炎支原体抗原包被硝酸纤维素膜:用生理盐水将肺炎支原体抗原稀释成lmg/ml， 然后用喷膜仪将肺炎支原体抗原在硝酸纤维素膜上按1.2yl/cm进行划线包被，同时在硝酸 纤维素膜上按1.2yl/cm包被鼠抗肺炎支原体单克隆抗体，用于产品的质控线，包被完成后 将硝酸纤维素膜在干燥间室温干燥8h，备用。 (3) 试纸条的组装:在干燥间内准备好吸水滤纸、样品垫、PVC底板，在PVC底板中央贴上 包被好的肺炎支原体抗原硝酸纤维素膜，硝酸纤维素膜上缘粘贴吸水滤纸，硝酸纤维素膜 下缘粘贴包被肺炎支原体抗原胶体金垫，胶体金垫下缘粘贴样品垫，完成后用裁切机将贴 好的试纸板切成5_宽的试纸条。再将试纸条密封于铝箱袋中，完成产品的组装。
【文档编号】G01N33/532GK105823875SQ201610148335
【公开日】2016年8月3日
【申请日】2016年3月15日
【发明人】程明
【申请人】威尚生物技术（合肥）有限公司