猪疾病多联快速检测试纸条及其制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种猪疾病多联快速检测试纸条及其制备方法。该试纸条采用双抗原夹心法，利用葡萄球菌A蛋白(SPA)作为捕获抗原，分别以酵母表达的猪瘟、蓝耳病、O型口蹄疫病毒主要抗原区(rED)作为检测抗原。本发明试纸条不需专业人员操作，不需借助任何仪器，检测耗时短且制备简单。采集一份血清样品，可同时检测猪瘟、猪蓝耳病和猪O型口蹄疫病毒抗体。能够满足基层组织、农户对于重大疫病诊断的需求。
【专利说明】
猪疾病多联快速检测试纸条及其制备方法
技术领域
[0001 ]本发明涉及一种动物疫病检测试剂，具体涉及一种可同时检测猪瘟、蓝耳病和O型口蹄疫病毒抗体的免疫层析试纸条，本发明还涉及该试纸条的制备方法，属于生物技术领域。
【背景技术】
[0002]猪痕(classical swine fever，CSF)俗称烂肠痕，是感染猪的一种急性、热性、高度接触性传染病。猪瘟会导致患病猪发烧、厌食、腹泻、死亡等，可造成母猪流产、仔猪大批死亡。猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)由于发病猪出现耳朵发绀症状，又称蓝耳病。蓝耳病主要感染繁殖母猪和仔猪，引起免疫抑制，对猪链球菌病有诱发作用。口蹄疫(foot and mouth disease，FMD)是一种多宿主传染病，猪、牛、羊等偶蹄类动物最易感。猪O型口蹄疫发病率高，传播迅速，可造成母猪流产、仔猪大批死亡。猪瘟、高致病性猪蓝耳病和口蹄疫是对养猪业危害最严重的三种猪病，被世界动物卫生组织(OIE)列为A类传染病和法定申报动物疫病，我国也将其列为一类传染病。目前，我国针对这三种猪病采取强制免疫与疫情监测相结合的净化策略，疫苗免疫成为影响疫病防控的关键，而针对疫苗建立合适的评价手段具有重要意义。
[0003]目前，疫苗免疫效果评价主要依赖ELISA方法。国内外有许多动物疫病血清抗体检测试剂，如美国爱德士(IDEXX)和韩国金诺(JBT)的猪瘟阻断ELISA试剂盒，中国兽医药品监察所的猪瘟间接ELISA试剂盒。ELISA敏感性高，可平行检测多份样品，但是该方法耗时较长，间接ELISA需要约2h，阻断ELISA需要2?3h。此外，ELISA检测需要使用酶标仪等仪器，只能适用于具有实验硬件支持的机构，无法在临床一线等简陋条件下开展免疫监测。因此，研发病毒抗体快速检测手段对于猪病临床诊断与免疫监测具有重要意义，而基于免疫层析原理的胶体金试纸条检测技术操作简单，检测时间短，成为重要的血清学监测手段。目前已有类似专利CN103293306B胶体金检测卡，但是所使用大肠杆菌表达抗原，而原核表达系统缺乏蛋白质折叠的辅助因子，会影响构象抗原表位形成，并最终影响蛋白活性。毕赤酵母表达系统属于真核表达系统，具有完备的蛋白加工修饰机制，且能实现可溶性表达，是免疫学研究的重要工具。
[0004]猪瘟病毒(CSFV)是一种囊膜病毒，基因组含有一个大的开放阅读框(ORF)，编码一种约3898个氨基酸的多聚蛋白。该多聚蛋白在翻译加工过程中被蛋白酶加工成12种成熟的病毒蛋白，包括C、E0、E1和E2等4种结构蛋白，其中囊膜糖蛋白E2是主要的保护性抗原蛋白。E2蛋白由ORF 5，端的690位氨基酸开始，到1060位氨基酸终止，共含有370个氨基酸，其4个主要的抗原位点均位于N端的690位和866位氨基酸之间。E2蛋白携带猪瘟病毒主要的保护性抗原决定簇，被认为是猪瘟基因工程疫苗和血清学诊断制品研发的重要靶标。蓝耳病病毒(PRRSV)是一种小RNA囊膜病毒，基因组合8个重叠的0RF，其中0RF5-7编码结构蛋白，分别为GP5、M和N蛋白。其中核衣壳蛋白N在免疫保护方面作用不大，但是保守性好、表达量高、抗原性强，是蓝耳病诊断检测的理想靶位。口蹄疫病毒(FMDV)无囊膜结构，衣壳蛋白由VP1、VP2、VP3和VP4四种结构蛋白组成。研究表明，0型FMDV表面至少含有5个中和抗原表位，其中最重要的3个表位集中在VP 1蛋白。VP 1蛋白诱导中和抗体产生，是FMD免疫预防、遗传演化的重要研究对象。
【发明内容】
[0005]本发明所要解决的问题是克服现有技术的不足，提供一种可同时检测猪瘟、蓝耳病、0型口蹄疫病毒抗体的胶体金试纸条。该试纸条不需专业人员操作，不需借助任何仪器， 检测耗时短且制备简单。本发明试纸条利用葡萄球菌A蛋白(SPA)作为捕获抗原，可同时结合多种疫病病原IgG抗体。此外，本发明试纸条分别以酵母表达的猪瘟、蓝耳病、猪0型口蹄疫病毒主要抗原区(rED)为检测抗原，具备特异性高，重复性好的特点。
[0006]本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案实现的:
[0007]—种猪疾病多联快速检测试纸条，试纸条包括底板、包被膜、玻璃纤维膜、吸水纸和样品垫。其中，包被膜的底面粘贴在底板上，包被膜正面的两端分别粘贴玻璃纤维膜和吸水纸。在玻璃纤维膜远离吸水纸一端的正面粘贴样品垫。在包被膜上设有检测线1、I1、III 和质控线，检测线1、I1、III分别包被猪瘟、蓝耳病、猪〇型口蹄疫病毒rED蛋白，质控线包被兔抗猪IgG抗体。所述玻璃纤维膜上喷涂SPA蛋白胶体金颗粒标记偶联物。
[0008]所述rED蛋白通过酵母表达系统GS115-pGAPZaA表达制备，猪瘟病毒主要抗原区 (rEDl)来源于E2基因，猪蓝耳病病毒主要抗原区(rED2)来源于N基因，猪0型口蹄疫病毒主要抗原区(rED3)来源于VP1基因。
[0009]本发明试纸条采用双抗原夹心法，当被检样品中含有猪瘟、蓝耳病和猪0型口蹄疫病毒抗体时，则在样品垫处与SPA胶体金颗粒标记偶联物结合，分别形成“SPA偶联物-病毒抗体复合物”，并在吸水纸的作用下向前渗透泳动。当复合物到达检测线I，猪瘟病毒抗体与 rEDl蛋白发生特异性结合，形成“SPA偶联物-猪瘟病毒抗体-rEDl复合物”，在包被膜上出现肉眼可见的色带。当复合物到达检测线II，蓝耳病病毒抗体与rED2蛋白发生特异性结合，形成“SPA偶联物-蓝耳病病毒抗体-rED2复合物”，在包被膜上出现肉眼可见的色带。当复合物到达检测线III，0型口蹄疫病毒抗体与rED3蛋白发生特异性结合，形成“SPA偶联物-口蹄疫病毒抗体_rED3复合物，，，在包被膜上出现肉眼可见的色带。当被检样品中不含猪瘟、蓝耳病、0型口蹄疫病毒抗体时，SPA胶体金颗粒标记偶联物泳动至质控线，与兔抗猪IgG抗体结合，在包被膜上出现肉眼可见的色带。检测时，吸取待检血清样品1滴，加入加样孔，观察检测线1、I1、III和质控线是否出现红色色带，从而判定动物体内是否含有猪瘟病毒、猪蓝耳病病毒和猪〇型口蹄疫病毒抗体。
[0010]本发明的积极效果是:
[0011]1、本发明试纸条结合胶体金技术和膜层析技术，操作便捷，不需要仪器，结果判读简单。相对于ELISA，试纸条原辅料更为简单，成本低，有益于推广应用。采集一份血清样品， 可同时检测猪瘟、猪蓝耳病和猪0型口蹄疫病毒抗体。能够满足基层组织、农户对于重大疫病诊断的需求。
[0012]2、本发明采用酵母真核表达系统制备试纸条上的检测用抗原蛋白。酵母为真核表达宿主，蛋白翻译后加工修饰机制更完善，表达蛋白活性尚。
[0013]3、本发明采用双抗原夹心法，不受样品的宿主来源限制，除检测猪瘟、蓝耳病和猪0型口蹄疫病毒抗体外，还可用于多种动物0型口蹄疫病毒检测。【附图说明】
[0014]图1为本发明试纸条的侧面结构示意图。图中1:底板;2:包被膜;3:玻璃纤维膜;4: 吸水纸;5:样品垫。[0〇15]图2为图1的正面结构不意图。图中6:检测线1;7:检测线11;8:检测线111;9:质控线。[〇〇16]图3为猪瘟病毒主要抗原区(rEDl)Western blot鉴定图。[〇〇17]图4为蓝耳病病毒主要抗原区(rED2)Western blot鉴定图。[〇〇18]图5为0型口蹄疫病毒主要抗原区(rED3)Western blot鉴定图。【具体实施方式】
[0019]下面结合附图具体介绍本发明的猪疾病多联快速检测试纸条及其制备方法。本领域技术人员应该理解，下面描述的实施例只是为了更好地理解本发明，并不用来限制本发明。
[0020]如图1所示，根据本发明的猪疾病多联快速检测试纸条包括底板1、包被膜2、玻璃纤维膜3、吸水纸4和样品垫5。其中，包被膜2粘贴在底板1上面，包被膜2正面的两端分别粘贴玻璃纤维膜3和吸水纸4。在玻璃纤维膜3远离吸水纸4的一端的正面粘贴样品垫5。底板1 通常为PVC材质，包被膜2为硝酸纤维素膜(NC膜)。在玻璃纤维膜3上涂覆有胶体金标记SPA 蛋白。
[0021]如图2所示，在包被膜上设有检测线16、检测线117、检测线III8和质控线9,检测线 16包被猪瘟病毒主要抗原区(rEDl)，检测线117包被蓝耳病病毒主要抗原区(rED2)，检测线 III8包被0型口蹄疫病毒主要抗原区(rED3)，质控线9包被兔抗猪IgG抗体。所述检测线16、 检测线117、检测线III8和质控线9在包被膜2上呈4条线平行排列，依据检测线16、检测线 117、检测线III8和质控线9是否出现红色色带来进行结果判定。
[0022]下述实施例中的主要原材料来源为:猪瘟病毒主要抗原区(rEDl )、蓝耳病病毒主要抗原区(rED2)、0型口蹄疫病毒主要抗原区(rED3)、猪瘟病毒抗体阳性血清、蓝耳病病毒抗体阳性血清、猪〇型口蹄疫病毒阳性血清为郑州中道生物技术有限公司制备并对外提供。 其中3种抗原为毕赤酵母真核系统表达，3种阳性血清均为商品化疫苗免疫动物制备。其它试剂和材料均是来源于商业途径。所述实验方法，若无特别说明，均为常规实验方法。
[0023]本发明的试纸条的具体制备方法如下:[〇〇24]1.1猪瘟、蓝耳病、0型口蹄疫病毒主要抗原区(rED)的制备
[0025]根据所检测的病原体，检索NCBI数据库并选择相应参考基因:猪瘟病毒 (AF531433.1)、蓝耳病病毒(EU807840.1)、0型口蹄疫病毒(JQ973889)。设计3对引物，分别扩增猪瘟、蓝耳病和0型口蹄疫病毒主要抗原区基因:[〇〇26](1)猪瘟病毒 rEDl:
[0027]p1:5' -TTTGAATTCAGACTAGCCTGCAAGGAAGATTAC-37 ；
[0028]P2:5/-TATGCGGCCGCGTTGAAGTCGAAGCCACACC-37 ；[〇〇29](2)猪蓝耳病病毒rED2:
[0030] P3:5,-TTTGAATTCATGCCAAACAACAACGGTAA-3,；
[0031 ] P4:5,-TTTGCGGCCGCAGCAGATGGGGAAGCAGTGA-37 ；
[0032](3)猪0型口蹄疫病毒rED3:
[0033]P5:57-TTTGAATTCACCAGCACCGGTGAAAGCGC-37 ；
[0034]P6:57-TTTGCGGCCGCCAGGCTCTGTTTCACCGGGG-37。
[0035]根据毕赤酵母密码子偏好性，对目的基因进行密码子优化，优化后的基因序列由金唯智生物公司合成。构建重组酵母菌pGAPZaA-GS115，并在YTO培养基中进行IL体积的发酵表达。收集发酵液上清透析过夜，然后进行蛋白活性分析。如图3、图4和图5所示，三种病毒的主要抗原区经酵母表达后有很好的抗原活性，经Western blot鉴定能与相应的阳性血清发生特异性结合。
[0036]1.2包被膜2的制备
[0037]在硝酸纤维素膜上分别喷涂猪瘟病毒主要抗原区(rEDl)、蓝耳病病毒主要抗原区(rED2)、0型口蹄疫病毒主要抗原区(rED3)和兔抗猪IgG抗体，并呈4条线平行排列，分组组成检测线16、检测线117、检测线III8和质控线9。37°(:烘干处理2h，置装有干燥剂的密封袋中保存备用。
[0038]检测线16:调试喷膜仪，喷液量为lyL/cm，用包被缓冲液稀释猪瘟病毒主要抗原区(rEDl)，浓度为2.5mg/mL，用喷膜仪喷涂划线。
[0039]检测线117:调试喷膜仪，喷液量为lyL/cm，用包被缓冲液稀释蓝耳病病毒主要抗原区(rED2)，浓度为3.0mg/mL，用喷膜仪喷涂划线。
[0040]检测线118:调试喷膜仪，喷液量为lyL/cm，用包被缓冲液稀释O型口蹄疫病毒主要抗原区(rED3)，浓度为3.0mg/mL，用喷膜仪喷涂划线。
[0041]质控线9:调试喷膜仪，喷液量为lyL/cm，用包被缓冲液稀释兔抗猪IgG抗体，浓度为lmg/ mL，用喷膜仪喷涂划线。
[0042]所述包被缓冲液配方:称取牛血清白蛋白0.0lg，十二水合磷酸氢二钠30.072g，磷酸二氢钾2.176g，用超纯水溶解，并定容至1000mL。
[0043]包被膜2上所划4条线应细致均匀，相邻两线间隔0.4-1.0cm。
[0044]1.3玻璃纤维膜3的制备
[0045](I)胶体金溶液的制备
[0046]将双蒸水置于磁力搅拌器上加热至沸腾，迅速加入浓度为I%的氯金酸溶液至终浓度为0.02%。煮沸5min，之后加入浓度为I %的柠檬酸三钠溶液，加样体积为氯金酸溶液的1.8倍。煮沸1min后，冷却至室温，再用双蒸水调整氯金酸浓度为0.02%，常温避光保存备用。
[0047](2)胶体金标记SPA玻璃纤维膜3的制备
[0048]用5M碳酸钾调节胶体金溶液PH至7.5-8.0，按60ug抗体/mL胶体金溶液的比例加入SPA蛋白，混匀后静置5min。再按5 %体积的量加入1 %牛血清白蛋白溶液，混匀后静置SmirulOOOOr/min离心30min，弃去上清，用标记洗涤液洗涤I次。沉淀用十分之一初始胶体金体积的金标蛋白保存液溶解，然后按照每毫升溶液铺1cm2的量喷涂于玻璃纤维膜3上。真空干燥3h，置装有干燥剂的密封袋中保存备用。
[0049]所述10%牛血清白蛋白溶液:取牛血清白蛋白10g，用双蒸水定容至1000mL。
[0050]所述标记洗涤液:取牛血清白蛋白4g，聚乙二醇80002g，聚乙烯吡咯烷酮2g，蔗糖 2g，Tris 1.211g，用双蒸水定容至1000mL，并调节PH至8.1。[〇〇511 所述金标蛋白保存液:取牛血清白蛋白25g，聚乙二醇80005g，Tris 10.2g，氢氧化钠2.5g，吐温207.5mL，用双蒸水定容至1000mL，并调节PH至8.5。[〇〇52]1.4大板组条[〇〇53] 各组份规格(长X宽):底板l(30cmX7.6cm)、包被膜2(30cmX2.0cm)、样品垫3 (30cmX 3.0cm)、涂覆胶体金标记SPA蛋白的玻璃纤维膜3(30cmX0.7cm)和吸水纸4(30cmX 3.2cm) 〇[〇〇54]各组份按组合方式如下:将包被膜2粘贴在底板1上面，包被膜2正面的两端分别粘贴玻璃纤维膜3和吸水纸4。在玻璃纤维膜3远离吸水纸4的一端的正面粘贴样品垫5。即在底板1上按顺序依次粘贴包被膜2、玻璃纤维膜3、吸水纸4、样品垫5。
[0055]1.5切条
[0056]用切条机将大板切成单条，每条宽度为3_5mm。
[0057]下面再详细描述本发明的试纸条检测原理和结果判定。[〇〇58]2.1试纸条检测原理
[0059]本发明试纸条采用双抗原夹心法，当被检样品中含有猪瘟、蓝耳病和猪0型口蹄疫病毒抗体时，则在样品垫5处与SPA胶体金颗粒标记偶联物结合，分别形成“SPA偶联物-病毒抗体复合物”，并在吸水纸4的作用下向前渗透泳动。当复合物到达检测线16,猪瘟病毒抗体与rEDl蛋白发生特异性结合，形成“SPA偶联物-猪瘟病毒抗体-rEDl复合物”，在包被膜2上出现肉眼可见的色带。当复合物到达检测线117,蓝耳病病毒抗体与rED2蛋白发生特异性结合，形成“SPA偶联物-蓝耳病病毒抗体-rED2复合物”，在包被膜2上出现肉眼可见的色带。当复合物到达检测线II18，0型口蹄疫病毒抗体与rED3蛋白发生特异性结合，形成“SPA偶联物-口蹄疫病毒抗体_rED3复合物”，在包被膜2上出现肉眼可见的色带。当SPA胶体金颗粒标记偶联物泳动至质控线9,与兔抗猪IgG抗体结合，在包被膜上出现肉眼可见的色带。检测时，吸取待检血清样品1滴，加入加样孔，观察检测线和质控线是否出现红色色带，从而判定动物体内是否含有猪瘟病毒、猪蓝耳病病毒和猪〇型口蹄疫病毒抗体。
[0060]2.2试纸条结果判定
[0061]阳性结果判定:当质控线9出现红色条带，检测线16、117、III8分别出现红色条带时，分别代表猪瘟、蓝耳病和〇型口蹄疫病毒抗体阳性。
[0062]阴性结果判定:当质控线9出现红色条带，而检测线I6、II7、III8无红色条带出现时，表明猪瘟、蓝耳病和〇型口蹄疫病毒抗体阴性。
[0063]无效结果:当质控线9不出现红色条带时，检测结果无效。
【主权项】
1.一种猪疾病多联快速检测试纸条，该试纸条包括底板、包被膜、玻璃纤维膜、吸水纸和样品垫； 其中，包被膜的底面粘贴在底板上，包被膜正面的两端分别粘贴玻璃纤维膜和吸水纸；在玻璃纤维膜远离吸水纸一端的正面粘贴样品垫;在包被膜上设有检测线1、I1、III和质控线，检测线1、I1、III分别包被猪瘟、蓝耳病、猪O型口蹄疫病毒rED蛋白，质控线包被兔抗猪IgG抗体，玻璃纤维膜上喷涂SPA蛋白胶体金颗粒标记偶联物。2.根据权利要求1所述的猪疾病多联快速检测试纸条，其中检测线1、I1、III和质控线呈平行布置，相邻两线间隔0.4-1.0cm03.—种猪疾病多联快速检测试纸条的制备方法，包括以下步骤: (1)将猪瘟、蓝耳病、猪O型口蹄疫病毒rED蛋白、兔抗猪IgG抗体分别用包被缓冲液稀释后形成浓度为1.0-3.0mg/mL的喷涂液；用喷膜仪在包被膜上分别喷涂划线相应喷涂液，形成检测线Ι、Π、ΙΙΙ和质控线； (2)将双蒸水置于磁力搅拌器上加热至沸腾，迅速加入氯金酸溶液;煮沸之后加入柠檬酸三钠溶液，加样体积为氯金酸溶液的1.5-3倍;煮沸10-30分钟后，冷却至室温形成胶体金溶液； (3)用碳酸钾调节胶体金溶液PH值至7.5-8.0，按60ug抗体/mL胶体金溶液的比例加入SPA蛋白，混匀后静置;再按5 %体积的量加入1 %牛血清白蛋白溶液，混匀后静置;离心弃去上清，用标记洗涤液洗涤;沉淀物用十分之一初始胶体金溶液体积的金标蛋白保存液溶解，然后按照每毫升溶液铺10-15cm2的量喷涂于玻璃纤维膜上，真空干燥后备用； (4)将步骤(I)中制成的包被膜粘贴在底板上面，再将步骤(3)中制成的玻璃纤维膜粘贴在包被膜的一端，将吸水纸粘贴在包被膜的另一端，在玻璃纤维膜远离吸水纸的一端的正面粘贴样品塾； (5)用切条机将步骤(4)中制成的大板切成宽度为3-5mm的单条，形成猪疾病多联快速检测试纸条。
【文档编号】G01N33/569GK105974116SQ201610544386
【公开日】2016年9月28日
【申请日】2016年7月12日
【发明人】张 杰, 王军, 王盼, 卜攀攀, 吴智坚, 王圆圆, 柴素真, 刘玉辉, 李伟豪, 曾小宇, 苗银萍, 余清卫, 赵林萍
【申请人】郑州中道生物技术有限公司