金刚烷胺药物残留快速检测试纸条的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种检测金刚烷胺药物残留快速检测试纸条，属于食品安全快速检测领域。
技术背景
[0002]金刚烷胺是最早用于抑制流感病毒的抗病毒药，美国于亚洲感冒流行的1966年批准其作为预防药。并于1976年在预防药的基础上确认其为治疗药。该药对成年患者的疗效及安全性已得到广泛认同。但治疗剂量与产生副作用的剂量很接近，对高龄者及有慢性心肺疾病或肾脏疾病者的剂量和给药计划很难确定，因此尚未在临床上推广应用。在日本，金刚烷胺一直作为帕金森病的治疗药，直到1998年才被批准用于流感病毒A型感染性疾病的治疗。
[0003]金刚烷胺可用于亚洲甲-1I型流感的预防和早期治疗，与抗菌素合用可治败血症和病毒性肺炎，并有退烧作用。也有抗震颤麻痹的作用。适用于原发性帕金森病、脑炎后的帕金森综合征、药物诱发的锥体外系反应、一氧化碳中毒后帕金森综合征及老年人合并有脑动脉硬化的帕金森综合征。
[0004]根据其药理作用，国内现在主要将金刚烷胺用于鸡、猪流感的预防和早期治疗，及猪传染性胃肠炎的防治。为避免影响国家动物疫病强制性免疫政策落实，给重大动物疫病防控工作带来不良后果，农业部发布《关于清查金刚烷胺等抗病毒药物的紧急通知》，规定除经批准生产、使用的疫苗产品外，禁止使用金刚烷胺防治高致病性禽流感等一类病原微生物引起的病毒性疫病。
[0005]2005年农业部《关于清查金刚烷胺等抗病毒药物的紧急通知》，已将金刚烷胺、金刚乙胺等列入《兽药地方标准废止目录》，明确要求立即停止生产、经营和使用，违者按生产、经营假兽药和使用禁用兽药处理。
[0006]2005年中国政府《农业部公告(第560号)》也明确指出，“金刚烷胺类等人用抗病毒药移植兽用，缺乏科学规范、安全有效实验数据，用于动物病毒性疫病不但给动物疫病控制带来不良后果，而且影响国家动物疫病防控政策的实施。”
2012年11月底被爆出养殖的一只鸡从孵出到端上餐桌，只需要45天，是用饲料和药物喂养的。其中一些不法商贩采用金刚烷胺人用药物，用于抑制禽类的禽流感等病症。其原因是价格低廉，但如果用量不当会导致其在禽类体内残留或禽流感病毒变异，人体食用后会对人体造成伤害。
[0007]我国对于动物源性食品中金刚烷胺残留含量的相关研究报道属于空白，也未曾制定或立项过国家标准、行业标准，国际上也无特定限量要求及相应检测方法。研究食品中金刚烷胺残留含量的检测技术，对于指导进出口食品中金刚烷胺含量控制，有效应对日本肯定列表制度，及时消除潜在的出口贸易障碍，促进相关行业拓展国际市场，具有紧迫的现实意义。
【发明内容】
[0008]本发明的目的:研制出特异、敏感、快速、简便的金刚烷胺药物残留快速检测试纸条。
[0009]本发明的技术方案:
一种金刚烷胺药物残留快速检测试纸条，底层为支撑层，中间层吸附层固定在支撑层上，外层保护膜固定在吸附层上，吸附层从测试端依次为纤维层，吸附金标抗体纤维层，纤维素膜层及手柄端的吸水材料层，其中在纤维素膜层上有用偶联金刚烷胺药物的载体蛋白溶液印制的直线式检测印迹，用羊抗或兔抗小鼠IgG溶液印制的直线式对照印迹，检测印迹和对照印迹平行组合排列为“II”。支撑层是用不吸水的硬质塑胶片条或硬纸条制成。测试端纤维层用玻璃棉、或尼龙膜、或聚偏二氟乙烯(PVDF)膜、或聚酚膜制成，优选玻璃棉。吸水材料层用吸水纸制成。纤维素膜层用硝酸纤维素膜、或纯纤维素膜，或梭化纤维素膜制成。金标抗体纤维层用吸附金刚烷胺药物的金标抗体玻璃棉，金刚烷胺药物金标抗体为胶体金标记金刚烷胺药物的单克隆抗体或多克隆抗体，偶联金刚烷胺药物的载体蛋白溶液为金刚烷胺药物与载体蛋白偶联的复合溶液。在测试端吸附纤维层、金标抗体纤维层及吸水材料层上覆盖有保护膜，在测试端纤维层与金标抗体纤维层交界处对应的保护膜上印制有样品标记线，该标记线偏向测试端纤维层一侧约0.5cm处。偶联金刚烷胺药物的载体蛋白为牛血清白蛋白(BSA ),或为鸡卵清白蛋白(0VA),或为铁蛋白，或为血蓝蛋白。
[0010]本发明的金刚烷胺药物残留快速检测试纸条具有以下优点:
(1)特异性强，敏感性高。该试纸条以胶体金标记高亲和力的单克隆抗体为基础制备而成，金标抗体中金颗粒与抗体分子之间无共价键形成，二者通过异性电荷间的范德华力相结合，胶体金标对单克隆抗体特异性和亲和力影响很小，且具有较高的标记率。因此，快速检测试纸条具有较高的特异性和敏感性。
[0011](2)操作简便、快速。使用本发明试纸条时无需任何其它试剂，只需滴加100 μ 1左右待检样品于样品垫上，在5分钟内即可判定检测结果。
[0012](3)结果显示形象、直观、准确。本测试纸条以显示红棕色“I”及“II”印迹作为检测的阳性和阴性标记，即在纤维素膜上显示一条棕红色“1”印迹表示在被检测样品液中含有金刚烷胺，两条棕红色“ II ”印迹表示在被检样品中不含金刚烷胺，结果判定形象、直观、准确，简单明了，不易出现假阴性和假阳性误判。
[0013](4)成本低，投资少。使用快速检测试纸条，不需另配仪器设备及其它试剂，随时随地进行检测，费用低廉，可节省大量贵重仪器及设备费用。
[0014](5)应用范围广，便于推广应用。本发明快速检测试纸操作简单，能满足不同层次人员的需要，包括专业化验、海关检疫、卫生防疫、质量监测、畜产品加工、集约化养殖到个体养殖等，具有广阔的市场前景和较好的经济、社会效益。
【附图说明】
[0015]图1为金刚烷胺药物残留快速检测试纸条结构示意图(其中1、样品吸收垫；2、结合物释放垫；3、反应膜；4、吸水垫；5、检测线；6.质控线；7、底板)。
[0016]图2为金刚烷胺药物残留快速检测试纸条俯视结构示意图(其中8-1和8-2是覆盖在试纸卡两端的保护膜，9为标记线)。
[0017]图3为金刚烷胺药物快速检测试纸卡阴性(图3.a )、阳性(图3.b)，无效(图3.c)显色示意图，其中T质控区，C为检测区。
【具体实施方式】
[0018]制备金刚烷胺药物残留快速检测试纸条，首先需制备偶联金刚烷胺药物的载体蛋白和金标抗体，从而制备检测印迹和金标抗体纤维；其次需制备羊抗或兔抗小鼠IgG抗体，用于制备对照印迹。
[0019]1.金刚烷胺药物与载体蛋白的偶联
分别采用混合酸酐法和碳化二亚胺法将金刚烷胺药物和卵清蛋白和血蓝蛋白偶联得到包被原(用于固定在反应膜上)和免疫原(用于制备单克隆抗体)。
[0020](1)包被原的制备:
①将5mg金刚烷胺药物0.5mL甲酰胺(DMF )溶解，冷却至10°C，加入氯甲酸异丁酯5 μ 1，4°C搅拌反应30min，即可得到反应液I液；
②称取卵清蛋白(OVA)30mg,使之充分溶解在2mL 50mM碳酸钠溶液中，即可得到反应液II液；其中金刚烷胺药物半抗原与所述卵清蛋白的摩尔配比为(15-20 ):1。
[0021]③将反应I液逐滴缓慢滴加到该反应II溶液中，4°C反应4 h，4 °C过夜。取最终反应物于PH7.4，0.02M磷酸盐缓冲液中透析纯化24 h，3000 g以上离心30 min,收集上清液，即得到包被原。
[0022](2)免疫原的制备:
①将5mg金刚烷胺药物、10mgN-羟基琥珀酰亚胺(NHS )，以及12.5 mg碳化二亚胺(EDC)充分溶解于1 mL DMF中，于室温下搅拌24 h，即可得到反应液I液；
②称取血蓝蛋白40mg，使之充分溶解在3 mL 40 mM碳酸钠溶液中，即得到反应液II液，其中金刚烷胺药物半抗原与所述血蓝蛋白的摩尔配比为(12-15):1。
[0023]③将反应液I液逐滴缓慢滴加到反应液II液中，并于室温下搅拌3 h，然后4 °〇过夜，过柱，用缓冲液平衡和洗脱，进一步纯化后得到免疫原。
[0024]2.抗金刚烷胺药物单克隆抗体的制备
(1)动物免疫:将免疫原注入到Balb/c小鼠体内，免疫剂量为100 μ g/只，使其产生抗血清。
[0025](2)细胞融合和克隆化:小鼠血清测定结果较高后，取其脾细胞，按7:1比例(数量配比)与SP2/0骨髓瘤细胞融合，采用间接竞争ELISA测定细胞上清液，筛选阳性孔。