一种快速检测维生素d的试纸条的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种快速检测维生素D的试纸条，包括不吸水的支撑板，所述支撑板上依次设置有样品垫、结合垫、层析膜和吸收垫，所述结合垫上包被有标记物标记的维生素D与载体蛋白的偶联物，所述层析膜为硝酸纤维素膜，层析膜上设置有质控C线和检测T线，所述检测T线位于结合垫和质控C线之间，检测T线上包被有维生素D特异性抗体，质控C线上包被有能够与载体蛋白结合的特异性抗体。本发明的试纸条使用方便，操作简单，检测速度快，容易普及到基层医疗单位使用，满足市场需求，能够填补国内外市场空白，试纸条结果判断容易，用符号表示，摆脱了维生素D检测对设备、仪器以及人员的特殊要求。
【专利说明】-种快速检测维生素 D的试纸条
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物检测【技术领域】，具体涉及一种快速检测维生素 D的试纸条。
【背景技术】
[0002] 维生素 D在调节人体内钙代谢、维持肌肉骨骼和免疫系统的健康和稳定、预防部 分恶性肿瘤发生有着不可或缺的作用。联合国卫生组织统计数据显示，全球大约90%人口 患有维生素 D不足之症。由于维生素 D的分子特性（高度亲脂性）使其分离提纯难度增 力口，检测条件要求高，限制了维生素 D检测在临床的推广应用，也限制了我们获得更多的有 关维生素 D的信息。到目前为止，已经报道并被临床接受的人血清维生素 D检测方法有试 剂盒检测以及仪器检测两类。
[0003] 一、仪器检测。1)直接检测法（Direct Detection Methodology)。这类方法中最 著名的是液相色谱分析法（HPLC)以及后来改进了的液相色谱-质谱联用分析法（LC/MS)。 2)自动分析检测仪（Automated Instrumentation Methodology)。仪器检测其优点是精确 度高，缺点是仪器投资大，样品必须有机溶剂提取并纯化，分析人员需要经过专业培训，并 且分析过程中有机溶剂消耗大，不利于环境保护。目前直接分析法多局限于研究型实验室 使用。
[0004] 美国的 Nichols Institute Diagnostics 公司，DiaSorin 公司以及德国 Roche Diagnostics公司分别宣布其研发出血清维生素 D自动检测仪器。应用此类自动分析仪， 血清样品不需要任何前期处理即可直接进行检测。此类仪器检测的原理是化学荧光分析技 术。其优点是仪器自动完成样品的分离，提取，检测，数据整理，结果判断等步骤。样品的检 测周期约一个半小时。其缺点是自动分析仪价格尤其昂贵，限制了其的推广使用。
[0005] 二、试剂盒检测，按作用原理又分为以下几种：
[0006] 1)竞争性蛋白结合分析法（CPBA)
[0007] 2)放射免疫分析法（RIA)
[0008] 3)酶联免疫吸附法（ELISA)
[0009] 目前已有的试剂盒检测分析方法基本上均使用免疫反应板，通过直接或间接酶联 免疫反应检测样品中维生素 D含量。在这些检测方法中，绝大多数需要进行样品的有机溶 剂提取，一些方法中反应物有同位素标记，易造成环境有机溶剂以及放射性物质污染，且检 测必须由专业人员在实验室通过仪器操作完成。平均检测过程在100分钟左右。
[0010] 由上述分析可以看出，目前已有的维生素 D检测方法，无论仪器检测或酶联免疫 反应板检测，其均存在着仪器设备投资高，检测人员要求高，检测过程中有机溶剂或放射性 物质污染等问题，使得维生素 D检测普及受到限制，这也造成临床用药缺少检验指标支持， 用药带有极大的盲目性，甚至给患者身体带来更多的危害。为此，开发一种操作简便、快速、 价格低、适合基层推广使用的血清维生素 D检测方法是未来的发展趋势，也是临床工作者 和广大患者的迫切要求。
[0011] 侧向层流免疫分析技术兴起在上世纪90年代，在近10年有了长足的发展，已经被 广泛应用于快速检测诊断领域。而维生素 D的检测由于样品提纯过程复杂，样品不稳定，标 准参照物难得等等原因，一直未能在临床广泛开展。
【发明内容】
[0012] 本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术的不足，提供一种快速检测维 生素 D的试纸条。该试纸条是基于竞争性免疫结合原理，采用侧向层析法检测维生素 D浓 度，其检测方法简单、结果易于判断、检测成本低廉，适合在基层医院、诊所以及体检中心等 单位使用，对于降低维生素 D检测成本、普及人体维生素 D检测、减少临床盲目用药具有重 要意义。
[0013] 为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种快速检测维生素 D的试纸 条，包括不吸水的支撑板，所述支撑板上依次设置有样品垫、结合垫、层析膜和吸收垫，其特 征在于，所述结合垫上包被有标记物标记的维生素 D与载体蛋白的偶联物，所述层析膜为 硝酸纤维素膜，层析膜上设置有质控C线和检测T线，所述检测T线位于结合垫和质控C线 之间，检测T线上包被有维生素 D特异性抗体，质控C线上包被有能够与载体蛋白结合的特 异性抗体。
[0014] 上述的一种快速检测维生素 D的试纸条，所述标记物为胶体金颗粒。
[0015] 上述的一种快速检测维生素 D的试纸条，所述载体蛋白为牛血清白蛋白，能够与 载体蛋白结合的特异性抗体为BSA免疫球蛋白。
[0016] 上述的一种快速检测维生素 D的试纸条，所述载体蛋白为鸡卵清白蛋白，能够与 载体蛋白结合的特异性抗体为兔抗鸡卵清白蛋白。
[0017] 上述的一种快速检测维生素 D的试纸条，所述维生素 D为25-羟基维生素 D3或 25-羟基维生素 D2。
[0018] 上述的一种快速检测维生素 D的试纸条，所述检测T线和质控C线之间的距离为 lcm〇
[0019] 上述的一种快速检测维生素 D的试纸条，所述维生素 D特异性抗体为鼠抗维生素 D单克隆抗体，维生素 D特异性抗体的包被量为2 μ L，包被浓度为0. 25mg/mL?5mg/mL。
[0020] 上述的一种快速检测维生素 D的试纸条，所述能够与载体蛋白结合的特异性抗体 的包被量为2 μ L，包被浓度为0· lmg/mL?1. Omg/mL。
[0021] 上述的一种快速检测维生素 D的试纸条，所述标记物标记的维生素 D与载体蛋白 的偶联物的制备方法包括以下步骤：
[0022] 步骤一、将lmg?10mg维生素 D溶解于100 μ L有机溶剂中，然后在搅拌条件下 向10mL浓度为0. lmg/mL?5mg/mL的载体蛋白溶液中逐滴加入溶解后的维生素 D，再逐滴 加入体积百分比浓度为50%的戊二醛水溶液至溶液中戊二醛的体积百分比浓度为1 %? 3%，搅拌5min?20min后移至4°C下搅拌反应16h?18h，反应后的反应液用PBS缓冲溶 液在4°C下透析8h，透析过程中换液2?3次，透析物离心后取上清液，最后将上清液用 0. 45 μ m滤膜过滤，得到维生素 D与载体蛋白的偶联物，-20°C保存备用；
[0023] 步骤二、向标记物溶液中加入步骤一中所述维生素 D与载体蛋白的偶联物至溶液 中维生素 D的终浓度为10 μ g/mL?1000 μ g/mL，搅拌5min后加入BSA溶液至BSA的质量 体积百分浓度为〇. 1 %?1 %，在4°C下避光搅拌反应30min后加入聚乙二醇溶液至聚乙二 醇的质量体积百分浓度为0. 1 %?1 %，继续反应5min后离心，弃去上清，将沉淀复溶后得 到标记物标记的维生素 D与载体蛋白的偶联物。
[0024] 上述的一种快速检测维生素 D的试纸条，步骤一中所述有机溶剂为正己烷、乙腈、 二甲基亚砜或1，4-二氧六环。
[0025] 本发明与现有技术相比具有以下优点：
[0026] 1、本发明的快速检测维生素 D的试纸条是基于竞争性免疫结合原理，采用侧向层 析法检测维生素 D浓度，其检测方法简单、结果易于判断、检测成本低廉，适合在基层医院、 诊所以及体检中心等单位使用，对于降低维生素 D检测成本、普及人体维生素 D检测、减少 临床盲目用药具有重要意义。
[0027] 2、本发明的试纸条使用方便，操作简单，检测速度快，容易普及到基层医疗单位使 用，满足市场需求，能够填补国内外市场空白。
[0028] 3、本发明的试纸条结果判断容易，用符号表示，摆脱了维生素 D检测对设备、仪器 以及人员的特殊要求。
[0029] 4、本发明的试纸条不仅可采用胶体金颗粒作为标记物，还可采用荧光化学物质、 染色剂、乳胶颗粒、酶或磁性颗粒作为标记物，按照常规方法进行维生素 D与载体蛋白的偶 联物的标记。
[0030] 下面结合附图和实施例，对本发明的技术方案作进一步的详细描述。
【专利附图】
【附图说明】
[0031] 图1为本发明试纸条的结构示意图。
[0032] 附图标记说明：
[0033] 1-支撑板；2-样品垫；3-结合垫；
[0034] 4一层析膜；5-检测T线；6-质控C线；
[0035] 7-吸收垫。
【具体实施方式】
[0036] 实施例1标记物标记的维生素 D (25-羟基维生素 D3)与载体蛋白的偶联物的制备
[0037] 步骤一、将 lmg 维生素 D (25〇HD33_HS，购于 Toronto Research Chemicals 公司）溶 解于100 μ L有机溶剂（正己烷、乙腈、二甲基亚砜或1，4-二氧六环）中，然后在搅拌条件 下向10mL浓度为0. lmg/mL的载体蛋白（牛血清白蛋白BSA，或鸡卵清白蛋白0VA)溶液中 逐滴加入溶解后的维生素 D，再逐滴加入体积百分比浓度为50%的戊二醛水溶液至溶液中 戊二醛的体积百分比浓度为1%，搅拌5min后移至4°C下搅拌反应16h，反应后的反应液用 PBS缓冲溶液在4°C下透析8h，透析过程中换液2?3次，透析物离心后取上清液，最后将上 清液用〇. 45 μ m滤膜过滤，得到维生素 D与载体蛋白的偶联物，-20°C保存备用；
[0038] 步骤二、向40nm胶体金溶液（0D1. 0,购于上海杰一生物公司）中加入步骤一中所 述维生素 D与载体蛋白的偶联物至溶液中维生素 D的终浓度为10 μ g/mL，搅拌5min后加入 BSA溶液至BSA的终浓度（质量体积百分浓度）为0· 1 % (即100mL溶液中含0· lg BSA)， 在4°C下避光搅拌反应30min后加入聚乙二醇溶液至聚乙二醇的终浓度（质量体积百分浓 度）为0. 1% (S卩100mL溶液中含0. lg聚乙二醇），继续反应5min后离心，弃去上清，将沉 淀复溶后得到标记物胶体金标记的维生素 D与载体蛋白的偶联物（含维生素 D30ng/mL? 40ng/mL)〇
[0039] 实施例2标记物标记的维生素 D (25-羟基维生素 D2)与载体蛋白的偶联物的制备
[0040] 步骤一、将 5mg 维生素 D (25〇HD2,购于 Toronto Research Chemicals 公司）溶解 于100 μ L有机溶剂（正己烷、乙腈、二甲基亚砜或1，4-二氧六环）中，然后在搅拌条件下 向10mL浓度为2mg/mL的载体蛋白（牛血清白蛋白BSA，或鸡卵清白蛋白0VA)溶液中逐滴 加入溶解后的维生素 D，再逐滴加入体积百分比浓度为50%的戊二醛水溶液至溶液中戊二 醛的体积百分比浓度为2%，搅拌10min后移至4°C下搅拌反应17h，反应后的反应液用PBS 缓冲溶液在4°C下透析8h，透析过程中换液2?3次，透析物离心后取上清液，最后将上清 液用0. 45 μ m滤膜过滤，得到维生素 D与载体蛋白的偶联物，-20°C保存备用；
[0041] 步骤二、向40nm胶体金溶液（0D1. 0,购于上海杰一生物公司）中加入步骤一中所 述维生素 D与载体蛋白的偶联物至溶液中维生素 D的终浓度为100 μ g/mL，搅拌5min后加 入BSA溶液至BSA的终浓度（质量体积百分浓度）为0. 5%，在4°C下避光搅拌反应30min 后加入聚乙二醇溶液至聚乙二醇的终浓度（质量体积百分浓度）为0. 5%，继续反应5min 后离心，弃去上清，将沉淀复溶后得到标记物胶体金标记的维生素 D与载体蛋白的偶联物 (含维生素 D30ng/mL ?40ng/mL)。
[0042] 实施例3标记物标记的维生素 D (25-羟基维生素 D3)与载体蛋白的偶联物的制备
[0043] 步骤一、将 10mg 维生素 D (25〇HD3,购于 Toronto Research Chemicals 公司）溶解 于100 μ L有机溶剂（正己烷、乙腈、二甲基亚砜或1，4-二氧六环）中，然后在搅拌条件下 向10mL浓度为5mg/mL的载体蛋白（牛血清白蛋白BSA，或鸡卵清白蛋白0VA)溶液中逐滴 加入溶解后的维生素 D，再逐滴加入体积百分比浓度为50%的戊二醛水溶液至溶液中戊二 醛的体积百分比浓度为3%，搅拌20min后移至4°C下搅拌反应18h，反应后的反应液用PBS 缓冲溶液在4°C下透析8h，透析过程中换液2?3次，透析物离心后取上清液，最后将上清 液用0. 45 μ m滤膜过滤，得到维生素 D与载体蛋白的偶联物，-20°C保存备用；
[0044] 步骤二、向40nm胶体金溶液（购于上海杰一生物公司）中加入步骤一中所述维 生素 D与载体蛋白的偶联物至溶液中维生素 D的终浓度为1000 μ g/mL，搅拌5min后加入 BSA溶液至BSA的终浓度（质量体积百分浓度）为1. 0%，在4°C下避光搅拌反应30min后 加入聚乙二醇溶液至聚乙二醇的终浓度（质量体积百分浓度）为1. 0%，继续反应5min后 离心，弃去上清，将沉淀复溶后得到胶体金标记的维生素 D与载体蛋白的偶联物（含维生素 D30ng/mL ?40ng/mL)。
[0045] 实施例4维生素 D单克隆抗体的制备
[0046] 以实施例1、实施例2或实施例3的步骤一中制备的维生素 D与载体蛋白的偶联物 作为免疫原，按50 μ g/只?200 μ g/只的剂量免疫Balb/c小鼠，使其产生抗血清；约6-8 周后取小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合得到杂交瘤细胞；所得杂交瘤细胞应用25-轻 基维生素 D3包被的免疫反应板，经过酶联免疫反应筛选得到稳定分泌抗25-羟基维生素 D3的单克隆抗体的细胞株，筛选得到的细胞株经过克隆复选，复选采用25-羟基维生素 D2 包被的免疫反应板，得到稳定分泌抗25-羟基维生素 D的单克隆抗体的细胞株；在DMEM 培养液中扩增培养细胞，细胞培养上清液经过离心，浓缩，经G蛋白（GE Healthcare Life Sciences)层析柱纯化，得到纯化后的鼠抗维生素 D单克隆抗体，-20°C保存备用。
[0047] 实施例5胶体金标记维生素 D结合垫的制备
[0048] 将玻纤膜（Ahlstrom8964)剪成5mm宽的长条，将剪好的玻纤膜置于平坦干净的玻 璃板上，将实施例1、实施例2或实施例3制备的胶体金标记的维生素 D与载体蛋白的偶联 物用稀释液稀释1. 5倍，然后按每试纸条20 μ L?50 μ L的量均匀地加在玻纤膜上，使玻纤 膜均匀浸透，在37°C烘干（60分钟），防潮避光保存备用，所述稀释液为含有蔗糖、Tween-20 和PEG20000的四硼酸钠溶液，稀释液中四硼酸钠的浓度为2mM?20mM，每100mL稀释液中 含有 0· 5g ?10g 蔗糖，0· lmL ?lmL Tween-20 和 0· 5g ?5g PEG20000。
[0049] 实施例6层析膜的制备
[0050] 层析膜选醋酸纤维素膜（millipore HF13502)，裁成30mm宽的条形；检测T线5上 包被鼠抗维生素 D单克隆抗体，包被浓度0· 25mg/mL?5mg/mL(优选0· 25mg/mL、0. 5mg/mL、 lmg/mL、2mg/mL、3mg/mL、4mg/mL或5mg/mL)，按2 μ L/试纸条抗体量制备，当采用的载体蛋 白为牛血清白蛋白时，质控C线6上包被BSA免疫球蛋白（购于上海瑞齐生物技术有限公 司），包被浓度为 〇· lmg/mL ?1. Omg/mL (优选 0· lmg/mL、0. 3mg/mL、0. 5mg/mL、0. 8mg/mL 或 1. Omg/mL)，按2 μ L/试纸条的抗体量制备，当采用的载体蛋白为鸡卵清白蛋白时，质控C线 6 上包被兔抗 0VA，包被浓度为 0. lmg/mL ?1. 0mg/mL (优选 0. lmg/mL、0. 3mg/mL、0. 5mg/mL、 0. 8mg/mL或1. Omg/mL)，按2 μ L/试纸条的抗体量制备，将裁好的醋酸纤维素膜固定于干净 的有机玻璃板上，应用划膜仪（上海杰一生物科技公司）制备检测T线5以及质控C线6, 检测T线5与质控C线6间距lcm ;将制备好的层析膜在室温下真空干燥1小时，密封避光 防潮保存。
[0051] 实施例7组装试纸条
[0052] 试纸条支撑板1购于上海杰一生物科技公司，支撑板1长7. 8cm，宽5mm ;将实施例 6制备的层析膜裁成宽5mm，长3cm的层析膜4,使检测T线位于层析膜4的中央；样品垫2 尺寸5mmX2. 3cm，吸收垫7尺寸5mmX2. 0cm ;按图1所示，将样品垫2、结合垫3、层析膜4 和吸收垫7依次粘贴于支撑板1上，样品垫2和结合垫3之间、结合垫3和层析膜4之间以 及层析膜4和吸收垫7之间均有1_?2_的重叠，得到快速检测维生素 D的试纸条，2°C? 8°C的环境中避光防潮储存，有效期12个月。
[0053] 实施例8试纸条的应用
[0054] 标准浓度样品制备：按照实施例1、实施例2或实施例3中步骤一的方法制备 25-羟基维生素 D与BSA的偶联物；HPLC检测偶联物中25-羟基维生素 D的浓度；通过离 心浓缩（Millipore Amicon centrifugal filter)得到标准样品，并使用BSA浓度为lmg/mL 的PBS溶液稀释标准样品，得到维生素 D浓度分别为：0ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、25ng/mL、 30ng/mL、35ng/mL、40ng/mL、60ng/mL 和 80ng/mL 的标准浓度样品，其中 0ng/mL 样品为 BSA 浓度lmg/mL的PBS溶液。
[0055] 标准浓度样品检测：取20 μ L的标准浓度样品加入样品垫靠近结合垫的区域；将 150 μ L检测剂逐滴加入样品垫靠近试纸条末端的部位，10?15分钟后观察结果；所述检 测试剂为含有蔗糖、Tween-20和PEG20000的四硼酸钠溶液，检测试剂中四硼酸钠的浓度为 2mM?20mM,每100mL检测试剂中含有0. 5g?10g鹿糖，0. lmL?lmL Tween-20和0. 5g? 5gPEG20000〇
[0056] 本发明试纸条的检测原理为：待检测样品与检测试剂混合液由毛细管引力引导沿 试纸条向反应膜扩散，混合液经过结合垫时，结合垫所包被的胶体金标记的维生素 D与载 体蛋白的偶联物被释放并随混合液沿反应膜扩散；待检测样品中的维生素 D与结合垫释放 的胶体金标记的维生素 D与载体蛋白的偶联物竞争与检测T线包被的维生素 D单克隆抗体 结合；若待检样品中维生素 D的含量高于所设定的检测阈值，则检测T线包被的抗体的结合 位点由样品维生素 D完全封闭，阻止胶体金标记的维生素 D与载体蛋白的偶联物与之结合， 检测T线不显色，而胶体金标记的维生素 D与载体蛋白的偶联物可与质控C线包被的能够 与载体蛋白结合的特异性抗体相结合，质控C线显色；若待检测样品液中维生素 D含量低于 所设检测阈值，则检测T线包被的抗体的结合位点不能被完全封闭，进而胶体金标记的维 生素 D与载体蛋白的偶联物与层析膜上维生素 D抗体结合，检测T线显色，同时质控C线抗 体也可与胶体金标记的维生素 D与载体蛋白的偶联物结合，质控C线显色；若质控区不显 不，则试纸条失效。
[0057] 结果判断：
[0058] 阴性：检测T线不显色，质控C线显出条带，判断为阴性，用表示，代表所检样 品维生素 D含量超过所设检测阈值（维生素 D含量充足）；
[0059] 阳性：检测T线和质控C线均显示出条带，判断为阳性，用" + "表示，代表所检样品 中维生素 D含量低于所设检测阈值（维生素 D含量不足）；
[0060] 无效：当质控C线不显色，则判断为无效试纸条。
[0061] 标准浓度样品检测结果见表1。
[0062] 表1标准浓度维生素 D样品检测结果
[0063]
【权利要求】
1. 一种快速检测维生素 D的试纸条，包括不吸水的支撑板（1)，所述支撑板⑴上依次 设置有样品垫（2)、结合垫（3)、层析膜（4)和吸收垫（7)，其特征在于，所述结合垫（3)上包 被有标记物标记的维生素 D与载体蛋白的偶联物，所述层析膜（4)为硝酸纤维素膜，层析膜 (4) 上设置有质控C线（6)和检测T线（5)，所述检测T线（5)位于结合垫（3)和质控C线 (6)之间，检测T线（5)上包被有维生素 D特异性抗体，质控C线（6)上包被有能够与载体 蛋白结合的特异性抗体。
2. 根据权利要求1所述的一种快速检测维生素 D的试纸条，其特征在于，所述标记物为 胶体金颗粒。
3. 根据权利要求1所述的一种快速检测维生素 D的试纸条，其特征在于，所述载体蛋白 为牛血清白蛋白，能够与载体蛋白结合的特异性抗体为BSA免疫球蛋白。
4. 根据权利要求1所述的一种快速检测维生素 D的试纸条，其特征在于，所述载体蛋白 为鸡卵清白蛋白，能够与载体蛋白结合的特异性抗体为兔抗鸡卵清白蛋白。
5. 根据权利要求1所述的一种快速检测维生素 D的试纸条，其特征在于，所述维生素 D 为25-轻基维生素 D3或25-轻基维生素 D2。
6. 根据权利要求1所述的一种快速检测维生素 D的试纸条，其特征在于，所述检测T线 (5) 和质控C线（6)之间的距离为lcm。
7. 根据权利要求1所述的一种快速检测维生素 D的试纸条，其特征在于，所述维生素 D 特异性抗体为鼠抗维生素 D单克隆抗体，维生素 D特异性抗体的包被量为2 μ L，包被浓度为 0· 25mg/mL ?5mg/mL〇
8. 根据权利要求1所述的一种快速检测维生素 D的试纸条，其特征在于，所述能够与载 体蛋白结合的特异性抗体的包被量为2 μ L，包被浓度为0. lmg/mL?1. Omg/mL。
9. 根据权利要求1所述的一种快速检测维生素 D的试纸条，其特征在于，所述标记物标 记的维生素 D与载体蛋白的偶联物的制备方法包括以下步骤： 步骤一、将lmg?10mg维生素 D溶解于100 μ L有机溶剂中，然后在搅拌条件下向10mL 浓度为〇. lmg/mL?5mg/mL的载体蛋白溶液中逐滴加入溶解后的维生素 D，再逐滴加入体积 百分比浓度为50%的戊二醛水溶液至溶液中戊二醛的体积百分比浓度为1%?3%，搅拌 5min?20min后移至4°C下搅拌反应16h?18h，反应后的反应液用PBS缓冲溶液在4°C下 透析8h，透析过程中换液2?3次，透析物离心后取上清液，最后将上清液用0. 45 μ m滤膜 过滤，得到维生素 D与载体蛋白的偶联物，-20°C保存备用； 步骤二、向标记物溶液中加入步骤一中所述维生素 D与载体蛋白的偶联物至溶液中维 生素 D的终浓度为10 μ g/mL?1000 μ g/mL，搅拌5min后加入BSA溶液至BSA的质量体积 百分浓度为〇. 1%?1%，在4°C下避光搅拌反应30min后加入聚乙二醇溶液至聚乙二醇的 质量体积百分浓度为〇. 1 %?1 %，继续反应5min后离心，弃去上清，将沉淀复溶后得到标 记物标记的维生素 D与载体蛋白的偶联物。
10. 根据权利要求9所述的一种快速检测维生素 D的试纸条，其特征在于，步骤一中所 述有机溶剂为正己烷、乙腈、二甲基亚砜或1，4-二氧六环。
【文档编号】G01N33/531GK104062440SQ201410308883
【公开日】2014年9月24日 申请日期:2014年6月30日 优先权日:2014年6月30日
【发明者】韩雅君 申请人:韩雅君