一种快速检测黄牛flii基因snp的rflp方法及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子遗传学领域，具体涉及一种检测黄牛FLII基因第9461位的单核 苷酸多态性的方法。
【背景技术】
[0002] 单核苷酸多态性（singlenucleotidepolymorphism，SNP)是指基因组DNA序列 中由于单个核苷酸（A/T/C/G)的变化而引起的多态性。它的变异形式有：颠换、转换、插入 和缺失等，主要由单个碱基的转换或者颠换所引起。SNP属于第三代分子标记，具有密度高、 双等位基因、易实现自动化检测等优点。由于SNP具有其它标记无法比拟的优点，所以它作 为一种研究工具已经在生命科学的各个领域得到广泛应用。
[0003] 目前，主要采用几种不同的路线来发现SNPs，即DNA序列测定方法、PCR-SSCP与 DNA测序结合法、AS-PCR方法、引物延伸法和寡核苷酸连接反应等。PCR-RFLP方法是一种 检测SNP的有效技术，在发现SNP位点后使用限制性内切酶进行切割，然后进行琼脂糖或聚 丙烯酰胺电泳分析，就能准确地鉴别SNP位点。PCR-RFLP方法不仅具有DNA测序法的准确 性，又克服了费用昂贵、操作繁琐、假阳性的缺点。
[0004] 分子育种，即分子标记辅助选择（molecularmark-assistselection,MAS)，是借 助DNA分子标记对遗传资源或育种材料进行选择，对畜禽的综合性状进行品种改良。在畜 禽育种中，通过对生长性状密切相关的、并且与数量性状紧密关联的DNA标记的选择，达到 早期选种和提高育种值准确性的目的，从而在畜禽育种中获得更大的遗传进展。
[0005] FLII(flightlessI)属于凝溶胶蛋白超家族，是凝溶胶蛋白和Ras信号转导通路 的搭桥蛋白，参与信号转导、细胞凋亡等调控，在脂肪分化、肿瘤发生和创伤愈合中发挥重 要作用。最新研究发现，FLII可通过竞争性结合RXRα负调控脂肪分化的关键基因PPARγ， 提示FLII可能调控牛的脂肪分化关键基因的功能发挥，影响牛的生长性状。
[0006] 目前，关于黄牛FLII基因遗传变异的研究，国内外尚未见相关报道。由于FLII基 因功能涉及脂肪代谢、信号转导、细胞凋亡等众多进程，因此，研究该基因遗传变异及其与 黄牛重要生长性状进行关联分析至关重要，可以为黄牛分子育种提供理论依据，便于黄牛 生长性状的标记辅助选择，快速建立遗传资源优良的黄牛种群。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于提供一种快速检测黄牛FLII基因SNP的RFLP方法及其应用。
[0008] 为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：
[0009] 一种快速检测黄牛FLII基因SNP的RFLP方法，包括以下步骤：以黄牛基因组DNA 为模板，以引物对P为引物，PCR扩增所述FLII基因内含子22区的部分片段，再用限制性 内切酶SacII对PCR扩增产物进行酶切，对酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，根据电泳 结果鉴定黄牛FLII基因的单核苷酸多态性；
[0010] 所述的引物对P为：
[0011] 上游引物F:5' -TCACGGAGCTCTTACTGACGC-3'，
[0012] 下游引物R:5' -CCGTCCAGGTCCTCGTT-3'。
[0013] 所述PCR扩增的反应程序为：95°C预变性4min;94°C变性30s，53°C退火30s，72°C 延伸30s，33个循环；72°C延伸lOmin。
[0014] 所述的琼脂糖凝胶的质量浓度为3. 5%。
[0015] 所述的SNP位点为C/A单核苷酸多态性，位于所述FLII基因的内含子22区，是所 述FLII基因的第9461位核苷酸位点。
[0016] 所述琼脂糖凝胶电泳检测后，电泳条带表现为：CC基因型表现为102bp和69bp，CA 基因型表现为171bp、102bp和69bp，AA基因型表现为171bp。
[0017] 上述快速检测黄牛FLII基因SNP的RFLP方法在黄牛分子育种中的应用，从而加 快良种选育速度。
[0018] 所述FLII基因的单核苷酸多态性与24月龄黄牛的生长性状显著相关，该单核苷 酸多态性所在位点具有AA、AC以及CC3种基因型，不同基因型的黄牛个体在体长、体高、胸 围、十字部高和尻长上存在显著差异，并且，优势基因型为AA型。
[0019] 与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：
[0020] 本发明提供的黄牛FLII基因单核苷酸多态性检测方法，针对第9461位C到A的 颠换突变，PCR扩增FLII基因内含子22区171bp的基因片段后，当由C突变成A时，不能 形成SacII识别位点，而没有发生突变时，则含有SacII识别位点，可以被SacII酶切， 从而能够简单、快速、成本低、精确地检测其单核苷酸的多态性，可用于黄牛的分子育种。
【附图说明】
[0021] 图1为黄牛FLII基因第9461位点测序图，框内所示为突变位点；
[0022] 图2是本发明中黄牛FLII基因酶切电泳结果图；泳道1为MarkerI，表现为 lOObp，200bp，300bp，400bp，500bp，600bp;泳道 2、8、11 为CC基因型，表现为 102bp和 69bp; 泳道1、3、4、5、6、7、9、10为0厶基因型，表现为17让？、102匕？和6%?;泳道12为厶厶基因型， 表现为171bp。
【具体实施方式】
[0023] 下面结合附图和实施例对本发明做详细说明。
[0024] 本发明利用PCR-RFLP方法检测黄牛FLII基因第9461位的单核苷酸多态性，并将 其与生长性状进行关联分析，验证其是否可以作为黄牛分子育种中辅助选择的分子标记， 从而加快良种选育速度。本发明对4个黄牛品种的SNP基因型进行了检测和基因频率分析， 对上述SNP位点与黄牛重要生长性状进行关联分析，结果表明该位点能够作为提高黄牛生 长性状的分子标记。
[0025] 1、黄牛样本采集
[0026] 本发明具体以4个中国地方黄牛品种的种群作为检测对象，具体采集样本见表1 : 河南南阳牛（62)，陕西秦川牛（165)，河南郏县红牛（210)，晋南牛（107);
[0027] 表1黄牛样本的采集
[0028]
[0029] 2、基因组DNA的分离、提取、纯化
[0030] 参考文献Sambrocketal(2002)方法。
[0031] 3、扩增引物设计
[0032] 以NCBI数据库（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)公布的牛FLII基因序列 (GenBankAccessionNo.AC_000176)为参考序列，利用Primer5.0设计PCR引物扩增FLII 基因内含子22区171bp片段，其引物对序列信息如下：
[0033] 上游引物F:5' -TCACGGAGCTCTTACTGACGC-3' （SEQ.ID.N0. 1)
[0034] 下游引物R:5，-CCGTCCAGGTCCTCGTT-3，（SEQ.ID.NO. 2)
[0035] 4、PCR克隆黄牛FLII基因内含子区171bp片段
[0036] PCR反应体系采用混合加样法，即根据每一个反应体系所需的各种组分的数量和 1次反应所需的PC