一种在线快速检测样品总抗氧化性的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于检测分析技术领域，涉及一种利用高效液相色谱和自由基检测系统在 线快速检测样品总抗氧化性的方法。
[0002]
【背景技术】
[0003]自20世纪80年代，出于对人工合成的抗氧化剂的安全性考虑，人们越来越倾向于 开发使用天然的抗氧化剂。从草药、水果和蔬菜中分离植物成分用作食品、化妆品和药品中 的防腐剂成为研究热点。例如水果、蔬菜，牛奶，脂肪、蛋黄和海鱼都是很好的抗氧化物质来 源。目前已经报道，具有潜在的抗氧化性的天然抗氧化物质有：茶多酚、大豆异黄酮、枸杞多 糖、天然虾青素、黄体素、硫辛酸、α-亚麻酸（ALA)、番茄红、维生素E、维生素C、β-胡萝卜 素、辅酶Q10、超氧化物歧化酶（S0D)、大豆肽、肌肽和谷胱甘肽、金属硫蛋白、硒，大蒜中的 硫化物，等。
[0004]目前，评价生物活性物质抗氧化能力的研究已经在全世界得到广泛关注。随着高 效液相色谱，质谱技术及以核磁共振等现代科学技术的出现及发展，抗氧化活性研究也出 现了在线抗氧化检测系统。大部分报道是指与HPLC联用的抗氧化在线检测技术。例如在线 HPLC-RSD(HighPerformanceLiquidChromatography-RadicalScavengerDetection) 或者HPLC-RSD-NMR/MS分析抗氧化活性系统。HPLC在线（On-line)抗氧化检测系统是指通 过HPLC系统与柱后自由基衍生系统连接起来，实现HPLC系统对样品中目的化合物质的洗 脱及分离，这些化合物洗脱出来，随流动相进入柱后自由基衍生系统，同时检测器检测化合 物清除自由基的能力。通常以自由基溶液色谱倒峰图体现。倒峰图面积越大，代表自由及 被清除的越多，代表样品的抗氧化性强。同时使用标准抗氧化物质浓度与负峰面积建立标 准曲线和标准物质抗氧化当量换算，从而实现分析样品的抗氧化活性。相对与在线检测方 法，文中提到的传统抗氧化研究方法称为非在（Off-line)法。HPLC联用的在线系统克服了 传统非在线抗氧化剂筛选方法纯化步骤繁琐，化合物提取、纯化和抗氧化性测定多步操作， 费时和费力的问题。HPLC联用的在线系统可以实现高效、快速对植物或食品中的天然抗氧 化物质进行分离、定性、定量的研究。高效液相色谱技术可以减少样品前处理的样品纯化步 骤，直接检测；生物化学检测柱后衍生系统的联用，有利于分析色谱系统分离出化合物的生 物活性。王小淞等选取DPPH自由基为检测 用自由基，检测了黄芩根提取物中的抗氧化活性成分。张雷等、傅茂润等也以相似的的 方法检测了茶叶、紫薯中的抗氧化物质。DPPH自由基稳定，系统组成与使用ABTS自由基类 似，但灵敏度不及ABTS自由基。裴世春等、高翔等、耿雪飞等利用ABTS自由基联用HPLC 检测植物材料中抗氧化物质。西北农林科技大学申请了利用ABTS自由基检测混合物中抗 氧化活性物质的发明专利（申请号201110330342. 6)。
[0005]物质总抗氧化能力（TotalAntioxidantCapacity)是物质清除不同的自由基或 者是物质的不同活性成分、清除不同的自由基的有效和。由于样品总抗氧化活性的好坏， 是筛选天然抗氧化资源的依据，也是进行抗氧化活性物质分离和鉴定的理论依据。评价物 质的总抗氧化活性是很有必要的。目前国内外常用的测定总抗氧化活性的方法有DPPH法， ABTS法，ORAC法，FRAP法。但是这些方法对于大规模的分析植物样品存在着操作步骤繁琐， 耗时耗力的缺点。大规模分析样品的总抗氧化性有望依赖目前已经报道HPLC在线检测系 统。ORAC法（由于其实验过程中荧光物质对pH敏感）和FRAP法（由于实验操作繁琐）， 都太不利于在线抗氧化检测。自由基捕获法，其自由基化学性质稳定，反应迅速适用于HPLC 在线抗氧化检测。目前已经实现了HPLC-DPPH法和HPLC-ABTS法在线检测植物样品抗氧化 性活性。但是目前报道的HPLC-DPPH/ABTS法的特点是在线分析单个化合物的抗氧化性，对 与总混合物的抗氧化活性并不能直接且快速的测定。关于HPLC-在线快速检测样品的总抗 氧化活性研究未见报道。所以，急需要建立一种快速的分析总抗氧化性的测定方法，并可以 被科研或工业所利用。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是针对现有的分析物质总抗氧化性的测定方法中存在的技术缺陷， 提供一种能够快速，准确地测定样品的总抗氧化性的方法，本发明方法测定过程中色谱图 峰型完整、美观，无拖尾现象；测定结果准确、快速、选择性强而且灵敏度高。
[0007] 为实现上述目的，本发明的技术方案为： 一种在线快速检测样品总抗氧化性的方法，是利用HPLC-FRSD分析系统检测样品总抗 氧化性的分析方法，所述HPLC-FRSD分析系统包括相互连接的高效液相色谱分析仪和自由 基反应检测装置，所述高效液相色谱分析仪包括依次连接的进样器、四元梯度泵、色谱分析 柱及柱温箱和光电二极管阵列PAD检测器；所述自由基反应检测装置包括自由基反应模 件、控温箱、高压泵和紫外可见光检测器，所述自由基反应模件与高效液相色谱仪相连接， 所述控温箱控制自由基反应模件温度，高压泵与自由基反应模件连接，自由基反应模件与 紫外可见光检测器相连接；所述色谱分析柱用C18反相色谱柱，型号为20X3. 9_，5um;所 述的自由基为化学自由基；所述的在线快速检测样品总抗氧化性的方法包括如下进行的步 骤： (1) 以体积分数为80-90%的甲醇，或者是其它具有相似极性的有机溶剂或所述有机溶 剂的混合物作为溶媒，于40-60°C超声波提取10_50min，再震荡提取l-15h，得提取液； (2) 将步骤（1)所得的提取液离心、分离，得上清液； (3) 配制一系列浓度梯度的维生素C水溶液作为标准物质，进行在线HPLC-FRSD分析， 建立负峰面积（Y)和相对应VC浓度（X)的线性方程； (4) 将步骤（2)中所得上清液经0. 22微米有机滤膜过滤后进行上样分析，将HPLC-FRSD 系统测得的样品负峰面积带入步骤（3)的线性方程，换算成维生素C当量，以求得各样品甲 醇提取物的抗氧化值。
[0008] 进一步，所述的一种在线快速检测样品总抗氧化性的方法，所述样品为植物固体 样品时，将植物固体样品干燥粉碎过60-100目筛再进行步骤（1)的操作。
[0009] 进一步，所述的一种在线快速检测样品总抗氧化性的方法，所述化学自由基选择DPPH自由基或ABTS自由基。
[0010] 进一步，所述的一种在线快速检测样品总抗氧化性的方法，所述DPPH自由基溶液 浓度为0. 2mM，DPPH自由基溶液检测波长为517nm。
[0011] 进一步，所述的一种在线快速检测样品总抗氧化性的方法，所述ABTS自由基溶液 的浓度为在400nm时吸光度为0.70 ± 0.02AU吸光值的浓度。
[0012] 进一步，所述的一种在线快速检测样品总抗氧化性的方法，所述高效液相色谱分 析仪使用的流动相为〇. 1%(V醋酸：V水=1:999)醋酸水溶液和甲醇的混合液，所述0. 1%醋 酸水溶液体积分数为37%，甲醇体积分数为63%。
[0013] 进一步，所述的一种在线快速检测样品总抗氧化性的方法，所述流动相的流速为 0. 91mLmin1 ;所述柱温箱设置的柱温为30°C，所述PAD检测器PAD检测波长：2D通道分 别设置283nm和245nm。
[0014] 进一步，所述的一种在线快速检测样品总抗氧化性的方法，所述自由基的引入流 速为0. 80mLmin\所述控温箱设置的温度为30°C。
[0015] -种在线快速检测柑橘样品总抗氧化性的方法，是利用HPLC-FRSD分析系统检测 柑橘样品总抗氧化性的分析方法，所述HPLC-FRSD分析系统包括相互连接的高效液相色 谱分析仪和自由基反应检测装置，