一种快速检测志贺氏菌的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及微生物检测领域，具体采用Fe304/RU(bqy)32+纳米微球集成免疫磁珠捕获技术和免疫层析快速检测志贺氏菌。
技术背景
[0002]志贺氏菌是一类革兰氏阴性杆菌，是细菌性痢疾最为常见的病原菌，通称痢疾杆菌。志贺氏菌主要侵害结肠，引发炎症并形成溃疡，严重者出现频繁的粘液性腹泻，在儿童和老年人中均有较高的感染率及死亡率。志贺氏菌病常为食物爆发型或经水传播，引起志贺氏菌病的食品主要有疏采，奶和奶制品，水果，肉制品，面包制品等。志贺氏菌在不卫生和人口密集的条件下可迅速传播，如餐厅、食堂。据统计，每年全球感染志贺氏菌的人数高达2亿，其中95%的致死病例发生在发展中国家。尽管我国尚未建立完善的食源性致病菌报告和检测机制，每年仅记录的志贺氏菌感染病例就高达40万，仅次于肝炎和结核。
[0003]目前检测志贺氏菌的金标准是传统分离鉴定法，该方法需经过预增菌、选择性增菌、分离培养、生理生化鉴定及血清型鉴定等步骤，整个过程繁琐耗时(3-7天)；ELISA法、PCR方法以及生物传感器法对志贺氏菌的检测灵敏度高，然而它们需要较长的检测时间、昂贵的仪器以及专业的技术人员。因此，建立快速、简单、灵敏的检测方法对食源性致病菌的检测具有重要意义。
[0004]胶体金免疫层析试纸条以其操作简单、快速(10-15min)、准确等特点成为基层筛选的重要工具，然而由于胶体金的光学信号有限，胶体金免疫层析试纸条的灵敏度不高，对志贺氏菌的检测限通常不高于105CFU/mL，这个缺陷限制了其在食品和农产品检测中的应用。因此，提高试纸条的灵敏度将为志贺氏菌的检测提供简单、高效的途径。
【发明内容】
[0005]本发明目的在于提供一种快速、灵敏、简便的志贺氏菌定性、定量检测技术。
[0006]本发明具体方案如下:
[0007]—种快速检测志贺氏菌的方法，包括以下步骤:
[0008]I)纳米微球的制备:
[0009]a.添加0.4-0.8mmolFeCl3.6H2O和0.2-1.6mmol FeCl2.4Η20到10mL的去离子水中，向溶液中通入氮气并加热到80-120°C，然后将3-7mL 25%的NH3.H2O添加到混合液中，反应2h ；用永磁铁从反应溶液中分离出黑色的固体物质用高纯水清洗3?5次，得Fe3O4纳米粒子；
[0010]b.取12mg Fe3O4纳米粒子用1-1OmL去离子水和20mL乙醇的混合液重悬，先在缓慢搅拌的条件下加入0.3-0.9mL的NH4OH溶液，再将10-300uL正硅酸乙酯溶解在50uL乙醇溶液中逐滴加入，室温下反应12h，在Fe3O4纳米粒子表面形成一层二氧化硅，用去离子水溶液清洗几次，在乙醇溶液中复溶得到二氧化硅包覆的Fe3O4纳米粒子；
[0011 ] c.把10_300uL的正娃酸乙酯，20mL无水乙醇，1-1OmL去离子水和ImL 0.5_3mg/L的啡啰啉联钌(Ru (bqy )32+)混合，将混合溶液加入0.5mL 二氧化硅包覆的Fe3O4纳米粒子，最后加入600-900yL的NH40H，剧烈搅拌3h，得到Fe304/Ru(bqy)32+纳米微球，用去离子水清洗备用；
[0012]d.将ImL的巯丙基三甲氧基硅烷添加到1mL的乙醇溶液中，用该混合物复溶Fe3O4/Ru(bqy)32+纳米微球，在常温下300rpm搅拌12h后，再80°C300rpm搅拌lh，离心得到娃烧化的Fe304/Ru(bqy)32+纳米微球;
[0013]e.将硅烷化的Fe304/Ru(bqy)32+纳米微球添加到包含0.06g NaHCO3，0.08g十二烷基苯磺酸钠，0.05mL苯乙烯，0.15mL丙烯酸和0.5g过硫酸钾溶液的50mL的水溶液，水浴70°C，200r/min下搅拌，反应5h后得羧基化的Fe304/Ru(bqy)32+纳米微球；
[0014]2)取0.5_2mg羧基化的Fe304/Ru(bqy)32+纳米微球加入ImL偶联缓冲液中，调节pH至5-10，加入0.05-0.18mg 1_(3_ 二甲氨基丙基)_3_乙基碳二亚胺盐酸盐
[0015](EDC)活化羧基，及100-400yg抗志贺氏菌单抗，在温度37°C时，放在10-15rpm的旋转仪上偶联60-120min，磁分离3-5min，弃上清；用清洗缓冲液冲洗3-5遍之后，取ImL封闭剂与纳米微球混合封闭0.5-lh，得到Fe304/Ru(bqy)32+纳米微球-单抗；
[0016]所述偶联缓冲液配制方法如下:将3mL 19.07g/mL的硼砂与7mL 12.37g/mL的硼酸混合后，稀释10倍体积；
[0017]所述清洗缓冲液配制方法如下:称取0.43g 2-(N-吗啡啉)乙磺酸(MES)溶于200mL的无菌蒸馏水中，调pH为5.5-6.0；
[0018]所述封闭剂配制方法如下:取10mg牛血清白蛋白(BSA)加入ImL磷酸盐(PBS)缓冲液配成封闭剂；
[0019]3)培养志贺氏菌，将菌液调整浓度为 106CFU/mL、105CFU/mL、104CFU/mL、103CFU/mL，各取ImL备用；取待测样品溶液lmL、各浓度菌液lmL，分别与100-150yg Fe304/Ru(bqy)32+纳米微球-单抗，于温度37°C，旋转仪转速10-15rpm混合孵育30-60min，孵育后磁分离3-5min后，弃上清，用PBS缓冲液清洗后，复溶于PBS中得Fe304/Ru(bqy )32+纳米微球-单抗-菌；
[0020]4)免疫层析试纸条的制备:将样本垫用pH 8.50.1M Tris-HCl缓冲液(I %BSA，
0.5%TWeen-20)浸泡处理，置于60°C鼓风干燥箱，2h后取出备用;将志贺氏菌兔多抗和驴抗鼠二抗喷到硝酸纤维膜上分别作为检测线(T线)和质控线(C线)，浓度均为l-2mg/mL，喷量均为0.75uL/cm，37°C真空干燥过夜取出置于干燥缸中备用；将过滤垫、样本垫、硝酸纤维膜、吸水纸依次粘贴在PVC底板上，贴好后将其切成4mm宽的试纸条，装卡;将制备好的试纸条装入铝箔袋中，加干燥剂密封，置于干燥缸中保存备用；
[°021 ] 5)试纸条对样品的检测:将收集到的Fe304/Ru(bqy)32+纳米微球-单抗-菌稀释到50-150yg/mL，取10yL滴加到试纸条加样孔中，10-15min后，用荧光读取仪记录T线、C线荧光强度和T/C的值；
[0022]6)定性分析:用肉眼观察结果进行定性分析，T线显色则说明样品中有志贺氏菌，T线不显色则说明样品中没有志贺氏菌或是含有志贺氏菌的量低于103CFU/mL;
[0023]7)定量分析:使用荧光读取仪测量T线、C线的荧光强度，以及T/C值，以不同菌的浓度为横坐标，T/C值为纵坐标绘制标准曲线，确定普通样品中的志贺氏菌数量。
[0024]所述步骤l)Fe304/Ru(bqy)32+纳米微球粒径为80_210nm;
[0025]步骤3)所述免疫层析试纸条是在粘性底板上依次粘贴滤纸、样本垫、硝酸纤维膜、吸水纸组成。使用志贺氏菌Fe304/Ru(bqy)32+纳米微球免疫层析试纸条，同时使用荧光读取仪定量检测的方法，其特征在于:配制已知系列浓度的志贺氏菌溶液，用荧光读取仪测出其对应的荧光强度，根据这一系列数值与对应浓度建立标准曲线，然后将检测样品的试纸条放入荧光读取仪中，根据荧光读取仪输出的数值，查标准曲线图即可得出样本中志贺氏菌的含量。
[0026]本发明有以下优点:
[0027]I)本发明具有操作简单、检测时间短(10-15min)等优点，适于进行现场检测；
[0028]2)本发明技术方案检测稳定性好，检测灵敏度高，检测限能达到103CFU/mL。采用的Fe304/Ru(bqy)32+纳米微球，不仅具有磁性纳米粒子的超顺磁性能，对样品进行浓缩富集，而且具有Ru(bqy)32+纳米微球强的光学信号、Ru(bqy)32+纳米微球表面高效偶联抗体的性能，从而提高了试纸条的检测灵敏度。
[0029]3)本发明无需将志贺氏菌从免疫磁珠上洗脱下来的步骤，提高了捕获效率;免去了将免疫标记物喷在结合垫上的步骤，免疫学反应更加均一，定量检测时变异系数小;减少了工作量和杂菌污染概率。
[0030]4)能同时对目标物志贺氏菌进行定性及定量检测。
[0031 ] 5)本发明的标记物为羧基化的Fe304/Ru(bqy)32+纳米微球，该标记物主要通过化学偶联的方式标记抗体，相比传统胶体金(物理吸附作用)，能够捕获更多抗体，从而提高检测灵敏度，另外，该标记物羧基修饰的稳定结构能提高材料的稳定性，提高保存期为