一种快速检测沙门氏菌的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及微生物检测领域，具体采用Fe304/RU(bqy)32+纳米微球集成免疫磁珠捕获技术和免疫层析快速检测沙门氏菌。
技术背景
[0002]随着人民生活水平的不断提高，食品安全问题广泛受到社会各界关注和重视。在全球食品安全中毒事件中，由食源性致病菌引发的中毒事件已经对人类的健康和社会发展造成严重的损失和危害。沙门氏菌是自然界中普遍存在的一种食源性致病菌，在世界各地的食物中毒中沙门氏菌引发的中毒病例占第一位。沙门氏菌在自然界中具有广泛的宿主，很容易在动物与动物之间、动物与人之间、人与人之间直接或间接的途径进行传播。人类感染沙门氏菌的主要途径是食入被沙门氏菌污染水以及食品如:鸡蛋、牛奶、肉制品和蔬菜等。人类感染沙门氏菌的主要症状表现为为腹泻、胃肠炎、高烧和败血症等，严重危害人类的健康。
[0003]目前检测沙门氏菌的金标准是传统分离鉴定法，该方法需经过预增菌、选择性增菌、分离培养、生理生化鉴定及血清型鉴定等步骤，整个过程繁琐耗时(3-7天)；ELISA法、PCR方法以及生物传感器法对沙门氏菌的检测灵敏度高，然而它们需要较长的检测时间、昂贵的仪器以及专业的技术人员。因此，建立快速、简单、灵敏的检测方法对食源性致病菌的检测具有重要意义。
[0004]胶体金免疫层析试纸条以其操作简单、快速(10-15min)、准确等特点成为基层筛选的重要工具，然而由于胶体金的光学信号有限，胶体金免疫层析试纸条的灵敏度不高，对沙门氏菌的检测限通常不高于105CFU/mL，这个缺陷限制了其在食品和农产品检测中的应用。因此，提高试纸条的灵敏度将为沙门氏菌的检测提供简单、高效的途径。
【发明内容】
[0005]本发明目的在于提供一种快速、灵敏、简便的沙门氏菌定性、定量检测技术。
[0006]本发明具体方案如下:
[0007]—种快速检测沙门氏菌的方法，包括以下步骤:
[0008]I)纳米微球的制备:
[0009]a.添加0.4-0.8mmolFeCl3.6H2O和0.2-1.6mmol FeCl2.4Η20到10mL的去离子水中，向溶液中通入氮气并加热到80-120°C，然后将3-7mL 25%的NH3.H2O添加到混合液中，反应2h ；用永磁铁从反应溶液中分离出黑色的固体物质用高纯水清洗3?5次，得Fe3O4纳米粒子；
[0010]b.取12mg Fe3O4纳米粒子用1-1OmL去离子水和20mL乙醇的混合液重悬，先在缓慢搅拌的条件下加入0.3-0.9mL的NH4OH溶液，再将10-300uL正硅酸乙酯溶解在50uL乙醇溶液中逐滴加入，室温下反应12h，在Fe3O4纳米粒子表面形成一层二氧化硅，用去离子水溶液清洗几次，在乙醇溶液中复溶得到二氧化硅包覆的Fe3O4纳米粒子；[0011 ] c.把10_300uL的正娃酸乙酯，20mL无水乙醇，1-1OmL去离子水和ImL 0.5_3mg/L的啡啰啉联钌(Ru(bqy )32+)混合，将混合溶液加入0.5mL 二氧化硅包覆的Fe3O4纳米粒子，最后加入600-900yL的NH40H，剧烈搅拌3h，得到Fe304/Ru(bqy)32+纳米微球，用去离子水清洗备用；
[0012]d.将ImL的巯丙基三甲氧基硅烷添加到1mL的乙醇溶液中，用该混合物复溶Fe3O4/Ru(bqy)32+纳米微球，在常温下300rpm搅拌12h后，再80°C300rpm搅拌lh，离心得到娃烧化的Fe304/Ru(bqy)32+纳米微球;
[0013]e.将硅烷化的Fe304/Ru(bqy)32+纳米微球添加到包含0.06g NaHCO3，0.08g十二烷基苯磺酸钠，0.05mL苯乙烯，0.15mL丙烯酸和0.5g过硫酸钾溶液的50mL的水溶液，水浴70°C，200r/min下搅拌，反应5h后得羧基化的Fe304/Ru(bqy)32+纳米微球；
[0014]2)取0.5_2mg羧基化的Fe304/Ru(bqy)32+纳米微球加入ImL偶联缓冲液中，调节pH至5-10，加入0.05-0.18mg 1_(3_ 二甲氨基丙基)_3_乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)活化羧基，及200-600yg抗沙门氏菌单抗，在温度37°C时，放在10_15rpm的旋转仪上偶联60_120min，磁分离3-5min，弃上清；用清洗缓冲液冲洗3-5遍之后，取ImL封闭剂与纳米微球混合封闭0.5-lh，得到Fe304/Ru(bqy)32+纳米微球-单抗；
[0015]所述偶联缓冲液配制方法如下:将3mL 19.07g/mL的硼砂与7mL 12.37g/mL的硼酸混合后，稀释10倍体积；
[0016]所述清洗缓冲液配制方法如下:称取0.43g 2-(N-吗啡啉)乙磺酸(MES)溶于200mL的无菌蒸馏水中，调pH为5.5-6.0；
[0017]所述封闭剂配制方法如下:取10mg牛血清白蛋白(BSA)加入ImL磷酸盐(PBS)缓冲液配成封闭剂；
[0018]3)培养沙门氏菌，将菌液调整浓度为10%?1]/11^、10咜?1]/11^、1040?1]/11^、10咜卩1]/mL，各取ImL备用；取待测样品溶液lmL、各浓度菌液lmL，分别与100-150yg Fe304/Ru(bqy)32+纳米微球-单抗，于温度37°C，旋转仪转速10-15rpm混合孵育30-60min，孵育后磁分离3-5min后，弃上清，用PBS缓冲液清洗后，复溶于PBS中得Fe304/Ru(bqy )32+纳米微球-单抗-菌；
[0019]4)免疫层析试纸条的制备:将样本垫用pH 8.50.1M Tris-HCl缓冲液(I %BSA，0.5 % Tween-20)浸泡处理，置于60°C鼓风干燥箱，2h后取出备用;将沙门氏菌兔多抗和驴抗鼠二抗喷到硝酸纤维膜上分别作为检测线(T线)和质控线(C线)，浓度均为l-2mg/mL，喷量均为0.75uL/cm，37°C真空干燥过夜取出置于干燥缸中备用；将过滤垫、样本垫、硝酸纤维膜、吸水纸依次粘贴在PVC底板上，贴好后将其切成4mm宽的试纸条，装卡;将制备好的试纸条装入铝箔袋中，加干燥剂密封，置于干燥缸中保存备用；
[0020]5)试纸条对样品的检测:将收集到的Fe304/Ru(bqy)32+纳米微球-单抗-菌稀释到50-150yg/mL，取10yL滴加到试纸条加样孔中，10-15min后，用荧光读取仪记录T线、C线荧光强度和T/C的值；
[0021]6)定性分析:用肉眼观察结果进行定性分析，T线显色则说明样品中有沙门氏菌，T线不显色则说明样品中没有沙门氏菌或是含有沙门氏菌的量低于103CFU/mL;
[0022]7)定量分析:使用荧光读取仪测量T线、C线的荧光强度，以及T/C值，以不同菌的浓度为横坐标，T/C值为纵坐标绘制标准曲线，确定普通样品中的沙门氏菌数量。
[0023]所述步骤l)Fe304/Ru(bqy)32+纳米微球粒径为80_210nm;
[0024]步骤3)所述免疫层析试纸条是在粘性底板上依次粘贴滤纸、样本垫、硝酸纤维膜、吸水纸组成。使用沙门氏菌Fe304/RU(bqy)32+纳米微球免疫层析试纸条，同时使用荧光读取仪定量检测的方法，其特征在于:配制已知系列浓度的沙门氏菌溶液，用荧光读取仪测出其对应的荧光强度，根据这一系列数值与对应浓度建立标准曲线，然后将检测样品的试纸条放入荧光读取仪中，根据荧光读取仪输出的数值，查标准曲线图即可得出样本中沙门氏菌的含量。
[0025]本发明有以下优点:
[0026]I)本发明具有操作简单、检测时间短(10-15min)等优点，适于进行现场检测；
[0027]2)本发明技术方案检测稳定性好，检测灵敏度高，检测限能达到103CFU/mL。采用的Fe304/Ru(bqy)32+纳米微球，不仅具有磁性纳米粒子的超顺磁性能，对样品进行浓缩富集，而且具有Ru(bqy)32+纳米微球强的光学信号、Ru(bqy)32+纳米微球表面高效偶联抗体的性能，从而提高了试纸条的检测灵敏度。
[0028]3)本发明无需将沙门氏菌从免疫磁珠上洗脱下来的步骤，提高了捕获效率;免去了将免疫标记物喷在结合垫上的步骤，免疫学反应更加均一，定量检测时变异系数小;减少了工作量和杂菌污染概率。
[0029 ] 4)能同时对目标物沙门氏菌进行定性及定量检测。
[°03°] 5)本发明的标记物为羧基化的Fe304/Ru(bqy)32+纳米微球，该标记物主要通过化学偶联的方式标记抗体，相比传统胶体金(物理吸附作用)，能够捕获更多抗体，从而提高检测灵敏度，另外，该标记物羧基修饰的稳定结构能提高材料的稳定性，提高保存期为I年，传统胶体金保存期为6个月。