针对食品中的沙门氏菌和志贺氏菌的多重pcr检测用引物组、试剂盒及检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于食品微生物安全检测领域，涉及利用多重PCR技术对食品中的致病菌 进行快速检测鉴定的引物组、试剂盒及方法。具体而言，本发明涉及针对食品中的沙口氏菌 (Salmonellasp.)和志贺氏菌（Shigellasp.)的多重PCR检测用引物组、试剂盒及检测方 法。
【背景技术】
[0002] 近几年，食品安全事件频频出现，食品安全问题也越来越被社会公众所关注和重 视。许多食源性致病菌通过水和食物传播而引发食源性疾病，其发病率和死亡率都呈现逐 渐增加的趋势。在世界范围内，每年有超过30 %的人口感染食源性疾病，造成数十亿美元的 花销。预防和控制食源性疾病的发生和传播，已成为解决社会食品安全问题的重要举措之 一。能否及时有效地控制与预防食源性疾病的发生和传播，关键在于能否快速准确地检测 与鉴定食源性致病菌。
[0003] 沙口氏菌和志贺氏菌是引起食源性疾病主要的两类致病菌，国内外由送两类致病 菌引发的食物中毒事件频频发生。送两类致病菌在食品中分布比较普遍，其污染食品后，不 仅导致食品腐败变质，还能产生多种毒素，造成严重的疾病，如沙口氏菌会引起局部化賊感 染、肺炎、伪膜性肠炎、必包炎、败血症、賊毒症等；志贺氏菌会引起肠炎、肠溃瘍、肠功能奈 吉U中毒性休克等。
[0004] 目前世界各国都把沙口氏菌和志贺氏菌列为食品卫生的法定检测项目。在检测手 段上，目前国内外检测机构仍主要采用FDA、A0AC、ISO和GB等标准对沙口氏菌和志贺氏菌 进行检测，整个过程一般需要3-5天，上述检测手段操作复杂，检测通量不高，很难满足对 食源性致病菌进行快速准确检测的现实需求。因此，建立新的对沙口氏菌和志贺氏菌进行 快速检测的方法就显得尤为迫切。
[0005] 近年来，借助于免疫学和分子生物学等方法，对沙口氏菌和志贺氏菌的快速检 测有了很大发展，目前国内外针对沙口氏菌和志贺氏菌进行快速检测的方法很多，如； PCR-凝胶电泳法、实时英光PCR法、基因芯片测试法、全自动细菌生化检定仪、酶联免疫吸 附法、英光免疫检测法（VIDA巧、胶体金免疫测试条等。但是，免疫学方法如酶联免疫吸附 法、免疫英光法和乳胶凝集试验等在操作程序、检测时间和特异性等方面尚不理想，并且检 测成本极高；而在分子生物学方法方面，如PCR技术则W灵敏、特异、简便、快速、成本低等 优点被越来越多地应用。
[0006] W单目标基因为检测对象的常规单重PCR技术假阳性高、通量低、无法实现对多 个目标基因及多种目的菌的同时检测，相比之下，多重PCR技术能在同一PCR反应体系内 实现对多个目标基因的同步扩增，从而能够快速、灵敏、特异地检测食源性致病菌。具体而 言，多重PCR检测法采用将多个目标基因联用的方式，只要检测出多个目标基因中的任意 一种，即可做出初步判断；进而，通过不同目标基因间检测结果的互相映证，便可实现提高 检测准确度、降低假阳性率的效果。
[0007]目前，应用多重PCR对食品中的常见致病菌进行检测已有较多报道，但由于多种 因素，例如所选取的引物和模板的种类和浓度、Mg2+和dNTP的浓度等均可能对多重PCR的 结果产生影响，因此，同时检测的目标微生物种类越多，建立PCR体系的难度越大，检测的 特异性及灵敏度越难得到保证。
[000引在影响针对多菌种的多重PCR检测的诸多因素中，目标基因的数目和种类的选取 至关重要。若目标基因的数目过多，PCR体系中加入的引物对数量过多，产生非预期反应的 概率增大，导致电泳鉴定图中出现杂带或造成拖尾等，从而影响检测效率；而若将引物加入 不同的PCR体系分别进行反应，势必又会降低通量。另外，目标基因种类的选取对于是否能 够有效进行多重PCR检测而言也是关键因素之一：如果目标基因特异性过高（即种属分布 过窄），例如像大多数现有方法中所侧重的主要用于医学检测目的的毒素基因等，会造成检 测覆盖种类不足，从而造成漏检等问题；反之，则可能会引起假阳性率高等弊端。因此，对目 标基因数目和种类的选择仍亟待优化，具体而言，如何选择对于沙口氏菌和志贺氏菌的全 部菌株而言均具有高覆盖度和高特异性的目标基因，仍是多重PCR检测中的难题。
[0009] 进而，在目标基因选定后，针对多个目标基因进行的引物设计同样可能从根本上 影响多重PCR检测的结果；由于需要在同一PCR体系中针对不同目标基因进行同步扩增，适 宜各引物对的反应条件需能够彼此配合、且各引物对之间不会相互干扰，从而确保针对各 目标基因的PCR反应均能够顺利、准确地进行。
[0010] 此外，考虑到食品中仅含有少量沙口氏菌或志贺氏菌即会引发食源性疾病，对检 测方法的灵敏度也存在较高要求。现有的PCR技术W沙口氏菌或志贺氏菌的基因组DNA为 模板时的检测灵敏度通常在10~l(K)pg/μL左右，且尚未有关于同时W如上两种菌的基因 组DNA为模板的多重PCR检测的灵敏度的报道。可见，现有技术并不能完全满足食品安全 国家标准的需求。因此，仍需开发灵敏度更高的PCR检测法。
【发明内容】
[0011] 针对W上不足，本发明组合利用了沙口氏菌和志贺氏菌的种属特异性鉴别基因， 采用多重PCR技术对沙口氏菌和志贺氏菌同时进行快速检测。在比对分析沙口氏菌和志贺 氏菌的种属特异性鉴别基因的基础上，设计筛选出针对两种细菌的种属特异性引物对及引 物组，优化组合建立了多重PCR检测体系，并开发了沙口氏菌和志贺氏菌多重PCR检测用试 剂盒；同时，结合样品前增菌和前处理技术，建立了检测覆盖范围广、特异性强且灵敏度高 的检测方法，由此完成了本发明。
[0012] 在第一方面，本发明提供了一种用于快速检测食品中的沙口氏菌和志贺氏菌的多 重PCR检测用引物组，所述引物组包括如下引物对：
[0013] 沙口氏菌检测用引物对：
[0014] 侵袭蛋白A基因（invA基因）扩增用引物对：
[0015] invA-F;TTGACGAGCTTTATCATTGTCTG(沈QIDNO. 1);
[0016] invA-R：ACGTCTTTTTCTCTTGGTGCC(SEQIDNO. 2),
[0017] 和 / 或
[001引侵袭基因正调节蛋白A基因化ilA基因）扩增用引物对：
[0019]hilA-F：TGAATTACGCTCACAACACCTG(SEQIDNO. 3)；
[0020] hilA-R：TGCTAAGCAACCAGATTACGATG(SEQIDNO. 4),
[0021] W及志贺氏菌检测用引物对：
[00过侵染性质粒抗原Η基因（ip址基因）扩增用引物对：
[0023]ipaH-F：CTCACATGGAACAATCTCCG(SEQIDNO. 5)；
[0024]ipaH-R：TCATTCTCTTCACGGCTTCTG(SEQIDNO.6),
[002引和/或
[0026] 侵染性质粒抗原B基因（ipaB基因）扩增用引物对：
[0027]ipaB-F;TGAAAGCAGTCATTGAACCC(沈QIDNO. 7);
[0028]ipaB-R;TGAGAGTTGGACATTGAGGC(沈QIDNO.8)。
[0029] 在第二方面，本发明提供了一种用于快速检测食品中的沙口氏菌和志贺氏菌的多 重PCR检测用试剂盒，所述试剂盒中包含本发明的多重PCR检测用引物组，所述引物组包括 如下引物对：
[0030] 沙口氏菌检测用引物对：
[0031] 侵袭蛋白A基因（invA基因）扩增用引物对：
[0032]invA-F;TTGACGAGCTTTATCATTGTCTG(沈QIDNO. 1);
[0033]invA-R：ACGTCTTTTTCTCTTGGTGCC(SEQIDNO. 2),
[0034]和 / 或
[0035] 侵袭基因正调节蛋白A基因化ilA基因）扩增用引物对：
[0036]hilA-F：TGAATTACGCTCACAACACCTG(SEQIDNO. 3)；
[0037]hilA-R：TGCTAAGCAACCAGATTACGATG(SEQIDNO. 4),
[0038]W及志贺氏菌检测用引物对：
[0039] 侵染性质粒抗原Η基因（ip址基因）扩增用引物对：
[0040]ipaH-F：CTCACATGGAACAATCTCCG(SEQIDNO. 5)；
[0041]ipaH-R：TCATTCTCTTCACGGCTTCTG(SEQIDNO.6),
[0042]和 / 或
[0043] 侵染性质粒抗原B基因（ipaB基因）扩增用引物对：
[0044]ipaB-F;TGAAAGCAGTCATTGAACCC(沈QIDNO. 7);
[0045]ipaB-R;TGAGAGTTGGACATTGAGGC(沈QIDNO.8)。
[0046] 在第H方面，本发明还提供了一种使用本发明的多重PCR检测用引物组或试剂盒 对食品中的沙口氏菌和志贺氏菌进行快速检测的方法，所述方法包括W下步骤：
[0047]a)从所述食品中获取模板DNA的前处理步骤；
[0048]b)使用本发明的多重PCR检测用引物组或试剂盒对所述模板DNA进行多重PCR扩 增的步骤；
[0049]C)对扩增产物进行检测的步骤，
[0050] 从而对所述食品中沙口氏菌和志贺氏菌的存在及含量进行分析。
[005。本发明所建立的针对食品中的沙口氏菌和志贺氏菌的多重PCR检测用引物组和 试剂盒及检测方法通过组合使用沙口氏菌的种属特异性鉴别基因invA和hi1AW及志贺氏 菌的种属特异性鉴别基因ipaB和ip址作为目标基因，具有检测适用面广、对沙口氏菌和志 贺氏菌种属覆盖全面、特异性强、灵敏度高等优势，从而有效解决了文献中报道的针对沙口 氏菌和志贺氏菌的多重PCR检测方法中由检测覆盖种类不足、引物特异性差及灵敏度不强 等因素造成的漏检、假阳性等问题。此外，本发明提供的针对食品中的沙口氏菌和志贺氏菌 的多重PCR检测方法还具备检测耗时短、操作较简单、设备要求低等特点，可大大节省检测 成本和时间，提高检测的通量及准确性，具有广泛的推广应用市场前景。
【具体实施方式】
[0052] 根据本发明的一些实施方式，除本发明的多重PCR检测用引物组外，本发明的多 重PCR检测用试剂盒中可进一步包含反应缓冲液、4种脱氧核巧Η磯酸、DNA聚合酶等成分。
[0053] 根据本发明一些优选的实施方式，除本发明的多重PCR检测用引物组外，本发明 的多重PCR检测用试剂盒中可进一步包含具有如下成分的PCR反应基础溶液；Tris-肥1 ; KC1 ;MgCl2;dATP、dTTP、dGTP及dCTP;W及TaqDNA聚合酶。
[0054] 根据本发明一些更为优选的实施方式，在本发明的多重PCR检测用试剂盒中，各 成分W如下浓度包含于25μL的PCR最终反应溶液中：
[00巧] Tris-HCllOrnM； 獻I 50mM； Μ装Ch :!.0~3.0mM: dATP、dTTP、dGTP没dCTJP 各 0J. -、03mM; Tiu]DN.A聚含黯 2.5U;
[0056] invA基因扩增用引物对和/或hilA基因扩增用引物对