一种鸡基因agk甲基化检测方法及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因工程技术领域，提供了一种鸡基因 AGK甲基化检测方法及其应用。
【背景技术】
[0002] 鸡肠炎沙门氏菌病是家禽生产中的常见疾病，肠炎沙门氏菌能够透过蛋壳进入鸡 蛋产品中，且能在生殖道中寄存繁殖。之前有报道，美洲等发达国家中发生的食物中毒事 件，大多数是由禽类的沙门氏菌而引起的，而其中，起主要作用的病原就是肠炎沙门氏菌。 肠炎沙门氏菌对家禽生产造成重大影响，引起畜禽发病，而且是食源性致病菌，能通过家禽 副产品给人类的健康带来很大的威胁，是报道最频繁的致病微生物之一。
[0003] AGK基因在疾病中尤其是癌症中具有重要的调控作用，已有研究证明AGK基因在各 种肿瘤中例如前列腺癌、食道鳞状癌症、卵巢癌、胃癌、乳癌等中表达上调。此外，AGK基因能 作为肝细胞癌一个新的药物作用靶点。到目前为止，尚未有关于AGK基因在鸡肠炎沙门氏菌 感染中发挥的甲基化调控作用的报道。
【发明内容】
[0004] 本发明的发明人针对上述现有技术的情况，结合长期研究和探索，提供了一种鸡 基因 AGK甲基化检测方法及其应用，该方法提供了鸡基因 AGK甲基化检测的特异性引物及配 合该引物使用的巢式PCR条件，利用上述引物和方法，可以准确检测鸡感染肠炎沙门氏菌后 AGK基因中的甲基化情况，并可以以此作为分子标记为鸡抗肠炎沙门氏菌感染提供理论依 据。
[0005] 发明人提供的具体技术方案如下：
[0006] -种鸡基因 AGK甲基化检测方法，所采用的方法为巢式PCR，所采用的鸡AGK基因特 异性的甲基化引物，其序列如下表所示：
[0007]
[0008] 上述引物前一对为第一对引物，后一对为第二对引物，利用上述2对特异性引物对 经亚硫酸盐对修饰处理后的鸡的全基因组基因 DNA进行巢式PCR，2次反应条件一致，其PCR 扩增反应体系如下，每20yL体系为：
[0009]
[0010] PCR扩增条件为：
[0011]
[0012] 其中所述的亚硫酸盐修饰处理采用QIAGEN公司甲基化修饰试剂盒对鸡基因组DNA 进行亚硫酸盐修饰处理，使未发生甲基化的胞嘧啶位置转换成尿嘧啶，而发生甲基化位点 因5'-甲基胞嘧啶的保护而不发生变化。
[0013] 而上述的PCR扩增条件也根据本发明的目的进行了对应调整，是在众多备选条件 中优选出的最佳条件，可配合本发明的特异性引物起到最佳的检测效果。
[0014] 所获得的扩增产物进行大肠杆菌克隆，转化成功后直接进行测序，测序结果显示， 肠炎沙门氏菌感染后AGK基因中所检测各CpG位点的甲基化受到抑制，利用这一特性，可以 作为肠炎沙门氏菌感染的甲基化分子标记。
[0015] 基于上述理由，利用本发明所述的鸡基因 AGK甲基化检测方法检测待测鸡群，可以 作为鸡抗肠炎沙门氏菌感染提供可靠的依据，并将其应用与养殖生产实践中。
[0016] 综上所述，本发明的发明人首次提供了一种鸡基因 AGK甲基化检测方法及其应用， 该方法提供了鸡基因 AGK甲基化检测的特异性引物及配合该引物使用的巢式PCR条件，利用 上述引物和方法，可以准确检测鸡感染肠炎沙门氏菌后AGK基因中的甲基化情况，并可以以 此作为分子标记为鸡抗肠炎沙门氏菌感染提供理论依据。
【具体实施方式】
[0017] 下述实施例中除特殊说明之外，所采用的均为本领域现有技术；
[0018] 实施例1
[0019] -种鸡基因 AGK甲基化检测方法，所采用的方法为巢式PCR，所采用的鸡AGK基因特 异性的甲基化引物，其序列如下表所示：
[0020]
[0021]选择肠炎沙门氏菌阴性的寿光鸡6-10只，试验组口服接种含菌量为109cfu的肠炎 沙门氏菌菌液0.3mL，对照组接种0.3mLPBS缓冲液，接种后14日采集盲肠样品，提取基因组 DNA，试验组和对照组各取3-5只。
[0022] 用QIAGEN公司甲基化修饰试剂盒对鸡基因组DNA进行亚硫酸盐修饰处理，使未发 生甲基化的胞嘧啶位置转换成尿嘧啶，而发生甲基化位点因甲基胞嘧啶的保护而不发 生变化。
[0023] 上述引物前一对为第一对引物，后一对为第二对引物，利用上述2对特异性引物对 上述经亚硫酸盐对修饰处理后的鸡的全基因组基因 DNA进行巢式PCR，2次反应条件一致，其 PCR扩增反应体系如下，每20yL体系为：
[0024]
[0025]
[0026] PCR扩增条件为：
[0027]
[0028] 扩增产物进行大肠杆菌克隆，转化成功后直接进行，测序检测发生甲基化的CpG位 点数量，测序结果显示AGK基因发生甲基化的CpG位点数量如下表：
[0029]表1AGK基因发生甲基化的CpG位点数量
[0030]
[0031] 结果显示对照组发生甲基化的CpG位点的个数为150个，处理组为129个，对照组显 著多于处理组。进一步比较每一个CpG位点在对照组与处理组中发生甲基化的百分比情况， 结果如下表所示，在检测到的7个CpG位点中，受肠炎沙门氏菌的影响，只有在CpG2对照组的 甲基化是小于处理组，其余6个位点均为对照组大于处理组。
[0032] 表4对照组与处理组甲基化CpG位点百分比
[0033]
[0034] 可见肠炎沙门氏菌感染后AGK基因中所检测各CpG位点的甲基化受到抑制，因此可 以作为肠炎沙门氏菌感染的甲基化分子标记，为鸡抗肠炎沙门氏菌感染提供理论依据。
【主权项】
1. 一种鸡基因AGK甲基化检测方法，其特征在于:所采用的方法为巢式PCR，所采用的鸡 AGK基因特异性的甲基化引物，其序列如下表所示：上述引物前一对为第一对引物，后一对为第二对引物，利用上述2对特异性引物对经亚 硫酸盐修饰处理后的鸡的全基因组基因DNA进行巢式PCR，两次反应条件一致，其PCR扩增反 应体系如下，每20yL体系为：所获得的扩增产物进行大肠杆菌克隆，转化成功后直接进行测序，以确定甲基化是否 受到抑制； 其中所述的亚硫酸盐修饰处理采用QIAGEN公司甲基化修饰试剂盒对鸡基因组DNA进行 亚硫酸盐修饰处理，使未发生甲基化的胞嘧啶位置转换成尿嘧啶，而发生甲基化位点因5^ 甲基胞嘧啶的保护而不发生变化。2. 权利要求1所述的鸡基因AGK甲基化检测方法在鸡抗肠炎沙门氏菌感染中的应用。
【专利摘要】本发明涉及基因工程技术领域，提供了一种鸡基因AGK甲基化检测方法及其应用，该方法提供了鸡基因AGK甲基化检测的特异性引物及配合该引物使用的巢式PCR条件，利用上述引物和方法，可以准确检测鸡感染肠炎沙门氏菌后AGK基因中的甲基化情况，并可以以此作为分子标记为鸡抗肠炎沙门氏菌感染提供理论依据。
【IPC分类】C12Q1/68
【公开号】CN105483264
【申请号】CN201610016846
【发明人】李显耀, 王莎莎, 吴桂贤, 王巧巧
【申请人】山东农业大学
【公开日】2016年4月13日
【申请日】2016年1月11日