一种特定基因片段的dna甲基化检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种生物（人、动物等）样品全基因组中特定基因片段的DNA甲基化 水平检测方法。
【背景技术】
[0002] 特定基因的DNA甲基化定量分析对癌症研究和诊断具有重要的意义，结合亚硫酸 氨盐处理的测序法度isulfite sequencingPCR，BS巧被公认为是甲基化分析的金标准。 该方法的基本过程是：DNA经亚硫酸氨盐处理后，未甲基化的胞喀晚脱氨基转变成尿喀晚， 而甲基化的胞喀晚保持不变，经PCR扩增，甲基化的胞喀晚扩增为鸟嚷岭，而尿喀晚扩增为 胸腺喀晚。对PCR产物进行克隆后测序，通过与基因库的序列比较和数据统计分析，可判断 CpG位点是否发生甲基化及甲基化程度的信息。此方法是一种可靠性及准确度均较高的方 法，既可W获得特定基因的甲基化位点，又可W获得该基因的甲基化定量的数据。但该分析 方法周期长，扩增出PCR产物后，经转染质粒和大肠杆菌培养，挑选质粒测序，分析一个样 品约需3-7天的时间。为了获得离散性较小的分析结果，需要较多数量的克隆测序（一般 > 10个克隆），否则会因挑选克隆的不同，分析结果差异大，然而大量克隆测序会带来巨大 的工作量和高昂的费用，因而影响了该方法的推广应用。
[0003] Herman等人提出的甲基化特异PCR(Methylation-specificPCR，MS巧是目前应 用较广的一种特定区域DNA甲基化检测技术，可W检测多个CpG位点的甲基化情况。该方法 W亚硫酸氨盐处理后的DNA产物作模板，加入甲基化特异性的引物或未甲基化的引物进行 特异性的扩增检测。若用甲基化特异性引物能扩增片段，说明该检测位点发生了甲基化；若 用未甲基化引物能扩增出片段，说明该检测位点未甲基化。该方法分析过程相对简单，灵敏 度较高。但存在明显的不足：①如果亚硫酸氨盐对DNA处理不完全，易导致假阳性；②MSP 法是W引物中所有CpG位点胞喀晚均完全甲基化或完全未甲基化为前提设计的，而事实上 CpG岛的CpG位点可能部分甲基化。所WMSP法常常存在目标片段难扩增，或者特异性差等 问题。
[0004] 除了MSP,还有甲基化敏感性高分辨率溶解曲线分析（methylation-sensitive hi曲resolutionmeltinganalysis,MS-HRM),甲基化敏感性限制性内切酶消化 (methylation-sensitiverestrictendonucleasedigestion，MS-RED)和实时巧光定量 PCR,单分子实时测序（single-moleculereal-timesequencing,SMRT)等方法相继被提 出。运些方法均存在受基因片段长度和CpG位点的限制、低灵敏度、低准确度、半定量、成本 高等不足，无法有效简便地对特定区域DNA甲基化进行准确定量。
[0005] 由于其高灵敏度和准确度，质谱（M巧已被用于区域DNA甲基化检测，如联合甲基 化敏感性限制性内切酶的质谱法（Combinationofmeth}dated-DNAprecipitationand methylation-sensitiverestrictionenzymesandmassspectrometry，COMPARE-MS)、 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（matrix-assistedlaserdeso;rpti〇]Vionization timeoffli曲tmassspectrometry,MALDI-TOFHVB)等方法相继被提出。但是，它们均为 半定量方法，而且数据处理复杂，难w适用临床的常规检测应用。
[0006] 因此，有必要对现有的特定基因片段的DNA甲基化水平的定量检测方法进行进一 步的改进。
【发明内容】
[0007] 为了弥补现有技术的不足，本发明提供了一种特定基因片段的DNA甲基化检测方 法，该方法可W实现快速、高效、准确地对特定基因片段的DNA甲基化水平进行定量检测。
[0008] 为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：
[0009] 一种特定基因片段的DNA甲基化检测方法，其特征在于，采用质谱、光谱、电化学 或巧光定量PCR技术直接测定裂解后的单个碱基或核巧含量，并通过公式计算样品中的 DNA甲基化水平。
[0010] 优选地，本发明按照W下步骤进行：
[0011] 1)DNA提取和重亚硫酸盐处理；
[0012] 2)特定基因片段的获取重亚硫酸盐处理后的基因组DNA为模板，采用聚合酶 链式反应、即PCR技术扩增特定基因片段，并通过琼脂糖凝胶电泳切胶纯化特定基因片段 的PCR产物；
[0013] 3)基因DNA片段的裂解：将纯化后的特定基因片段的PCR产物和同位素内标准混 合，采用甲酸进行裂解反应，使基因片段裂解成为单个碱基；
[0014] 4)采用液相串联质谱LC-MS/MS检测单个碱基或核巧的含量；
[001引W特定基因片段DNA甲基化率的计算：采用公式计算目的基因片段的DNA甲基化 率。
[0016] 优选地，本发明还可W按照W下步骤进行：
[0017] 1)DNA提取和重亚硫酸盐处理；
[0018] 2)特定基因片段的获取重亚硫酸盐处理后的基因组DNA为模板，采用聚合酶 链式反应、即PCR技术扩增特定基因片段，并通过琼脂糖凝胶电泳切胶纯化特定基因片段 的PCR产物；
[0019] 如基因DNA片段的酶解：采用DNA裂解酶、碱性憐酸酶和核酸内切酶处理目的基 因片段，得到单个核巧。
[0020] 4)采用液相串联质谱LC-MS/MS检测单个核巧的含量；
[002U5)特定基因片段DM甲基化率的计算：采用公式计算目的基因片段的DM甲基化 率。
[0022] 其中，所述液相串联质谱用于分离和检测DNA水解的碱基或核巧的含量。
[0023]其中，所述公式如下：
[0028] 其中：Peuacyt Μ为LC-MS/MS法检测基因PCR产物中鸟嚷岭和切t或核巧占总碱基或 核巧的百分比；Qcyt Μ和QAde Μ为LC-MS/MS法检测基因PCR产物中切t和Ade或核巧的摩尔 量；Pgua D和PCyt CpG D分别为未经亚硫酸盐处理的原始目的片段序列中Gua和CpG位点中的 切t或核巧占总体碱基的百分比。
[0029] 本方法通过商业试剂盒法提取生物样品的基因组DNA，经重亚硫酸盐转化后，采用 聚合酶链反应技术获得特定基因片段。采用化学裂解法或酶解法处理目的基因片段产物， 使其从链状序列裂解成单个碱基或核巧。采用内标法，通过LC-MS/MS检测胞喀晚和腺嚷岭 或核巧的含量，并根据公式计算目的基因片段的甲基化率。本专利的核屯、在于采用质谱、光 谱、电化学或巧光定量PCR技术直接测定裂解后的碱基A、T、G、C(测2种、3种或4种碱基 均可）或核巧含量，并通过自己推导的公式计算样品中的DNA甲基化水平。
[0030] 与现有的特定基因片段DNA甲基化检测方法相比，本发明的有益效果在于：一是 准确度高。本方法W液相串联质谱为检测手段，具有灵敏度高、全定量的特点，可W实现任 何生物样品，包括复杂的混合样品中特定基因片段DNA甲基化水平的准确定量。二是效率 高。本方法避免了一系列的DNA克隆和测序的繁琐步骤，大大提高了DNA甲基化检测的效 率。借助全自动的LC-MS/MS仪器，重亚硫酸盐处理和PCR之后的分析程序可在3至4小时 内完成，一天内可实现72至96个生物样品的检测。因此，本方法适合用于DNA甲基化的 高通量分析W及临床快速筛查。Ξ是应用性良好。只需通过PCR成功扩增特定基因片段， 无论基因序列的长短还是CpG位点含量的高低，本方法均可准确测定其DNA甲基化水平均 值。四是样品量需求小。基于高灵敏度的LC-MS/MS，本方法对胞喀晚和腺嚷岭的最低检测 限可达Ipg，因此，本方法可满足微量或难W获得的生物样品如肿瘤组织等的分析。五是成 本低。相比昂贵的测序和免疫巧光等方法，本方法采用化学裂解法或者酶解法处理DNA，并 使用LC-MS/MS进行检测，大大降低了检测花费。该方法的上述优点使得其特别适用于临床 检验。
【具体实施方式】
[0031] 下面通过具体实施例对本发明进行进一步的阐述。
[0032] 实施例1 :采用本方法测定肿瘤组织和癌旁组织pl6基因外显子2中的甲基化水 平。注：本实施例采用化学裂解法使基因片段裂解成为单个碱基。
[0033] 1、DNA提取和重亚硫酸盐处理
[0034] 采用商业化DNA提取试剂盒提取生物样品的基因组总DNA，并通过琼脂糖凝胶电 泳和紫外-可见光分光光度法检测DNA溶液的纯度和浓度。
[0035] 取一定量基因组DNA，采用商业化甲基化转化试剂盒进行重亚硫酸盐处理，使基因 组中未甲基化的胞喀晚（C)转化为尿喀晚扣)，而甲基化的胞喀晚不变。
[0036] 2、pl6基因外显子2片段的获得：
[0037] W重亚硫酸盐处理后的基因组DNA为模板，采用一对不含CpG位点的引物（上游： 5'-TGGTAGGTTATGATGATGGGTAG-3'，下游：5'-CTCAAATCATCAATCCTCACCTA-3'）通过聚合酶 链式反应技术扩增出pl6基因外显子2片段，并通过琼脂糖凝胶电泳切胶纯化特定基因片 段的PCR产物。 W38] 3、基因DNA片段化学裂解成为单个碱基A、T、G、C:
[0039] 将经琼脂糖凝胶纯化的基因目的片段放入反应瓶中，60°C下用成吹干，加入 100μΙ切t"Ci5N2(400ng/ml)和Adenine-2-"C(400ng/ml)的混合内标溶液，60°C下用成