Rna甲基化测序文库的构建方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及RNA测序领域，具体而言，设及一种RNA甲基化测序文库的构建方法。
【背景技术】
[0002] 表观遗传学是指在基因组DNA序列不发生改变的情况下，基因的表达和调控发生 了可遗传的变化，其现象主要包括DNA甲基化、组蛋白修饰、基因组印记和RNA修饰等。其中 RNA甲基化修饰广泛存在于哺乳动物、植物等真核生物中，主要的存在形式有m7G、Nm、m5C、 Hi6A和m6Am。不同形式的RNA甲基化在调控生物生长发育等过程中起着至关重要的作用，例如 Hi7G参与mRNA的翻译修饰、转移、剪切等，Nm甲基化经常用作宿主细胞识别自身mRNA和外源 mRNA的分子标记，而通过基因敲除等实验显示m5C、m6A在调控顶端发育和细胞命运等方面发 挥重要作用。甲基化修饰不改变沃森克里克配对，基于常规的反转录构建文库测序的方法 无法鉴定m 6A等RNA甲基化修饰位点，因此基于RNA免疫共沉淀(RNA Immunoprecipitation, RIP)的甲基化的RNA免疫沉淀测序(MeRIP-seq)方法对研究RNA甲基化位点非常必要。
[0003] 1970s中期，在哺乳动物（1975年）、病毒（1976年）、果蛹（1978年)和植物（1979年） 中陆续发现了 Hi6A的存在，2011年首次发现了 RNA甲基化修饰可逆化，近些年的研究发现RNA 的运种可逆修饰广泛存在于多种真核生物细胞中。RNA复杂的结构和功能关系使对RNA甲基 化修饰的研究受到抑制。2012年化n DominiSSini等建立了m6A-seq技术，成功实现了人和 小鼠转录水平上Hi6A高分辨率定位，并于2013年将运种基于免疫沉淀技术的MeRIP-seq方法 发表于Na化re Protocols，成为首个从整个转录水平研究RNA修饰的方法。
[0004] MeRIP-seq方法的产生主要基于染色体免疫共沉淀测序（ChIP-seq)和甲基化的 DNA免疫沉淀测序(MeDIP)方法的发展，通过RNA甲基化识别抗体特异结合发生甲基化的 RNA，对富集得到的RNA片段进行测序，通过测序序列(reads)的密度分布鉴定甲基化位点， 推测甲基化位点保守区域(motif),并对发生RNA甲基化修饰的相关基因进行注释分析。基 于RIP-seq对RNA甲基化进行定位分析的方法，对研究RNA甲基化修饰在真核生物中的生物 学功能有重要意义。
[000引下面Wm6A甲基化的建库流程来详细说明现有技术中所存在的缺陷：
[0006] 基于免疫沉淀法RNA的Hi6A甲基化的高通量测序文库构建的原理是通过甲基化特 异性的抗体与片段化后的mRNA中的Hi 6A甲基化结合，再通过蛋白A(蛋白A)磁珠将抗体富集 下来，最终在RNA提取后进行文库构建。具体的建库流程为：
[0007] (1)将总RNA通过Dyna磁珠 01 igo (dT)磁珠进行mRNA富集；
[0008] (2)将富集后的mRNA浓缩到lug/ul，加入片段化缓冲液，进行盐离子打断，用0.5M 邸TA进行终止打断过程；
[0009] (3)利用乙醇过夜沉淀片段化的RNA，然后收集溶解RNA，并留取一小部分做上样对 照（input),另一部分用来进行免疫沉淀(IP)实验；
[0010] (4)将待IP的样品等分为两管，均分别加入IP缓冲液和RNA酶抑制剂，其中一管加 入抗体，一管不加抗体(作为对照)放于4°C，旋转混匀仪上解育化；
[0011] (5)在抗体解育的同时，向20化L蛋白A磁珠离屯、弃上清，重悬于添加有BSA的IP缓 冲液中，然后置于4°C的旋转混匀仪上解育化进行预封闭；
[0012] (6)将预封闭后的蛋白A磁珠等分两份，离屯、弃上清，将解育好的样品（加抗体和不 加抗体)转移到含磁珠的离屯、管内，然后置于4°C的旋转混匀仪上解育化；
[0013] (7)离屯、弃掉磁珠中的上清，加入洗脱液进行洗脱；
[0014] (8)将洗脱液离屯、，收集上清，进行RNA提取；
[001引（9)对得至Ij的RNA进行反转录W及cDNA二链合成反应；
[0016] (10)将合成的双链DNA用XP磁珠纯化后进行末端修复加 A反应；
[0017] (11)将末端修复加 A的产物连接接头，并通过XP磁珠进行片段选择去掉未连接的 接头；
[0018] (12)对纯化后的片段进行PCR扩增，扩增产物等体积XP磁珠纯化出库。
[0019] (13)将构建完成的文库进行库捡，使用化seq 2500SE50进行测序，得到的数据进 行信息分析。
[0020] 然而，在实际使用中发现，利用上述方法所构建的RNA甲基化文库产出的数据中噪 音高，文库质量相对较低。因而，仍需要对上述方法进行改进W提高文库质量。
【发明内容】
[0021] 本发明的主要目的在于提供一种RNA甲基化测序文库的构建方法，W解决现有技 术中所构建的文库噪音高的问题。
[0022] 为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种RNA甲基化测序文库的构 建方法，该构建方法包括:步骤Sl，对RNA样品进行片段化，得到片段化RNA;步骤S2，利用RNA 甲基化特异性抗体对片段化RNA进行免疫共沉淀，得到沉淀物;步骤S3，利用蛋白酶对沉淀 物进行消化，得到消化物；步骤S4，从消化物中提取RNA并对提取的RNA进行逆转录，得到 CDNA; W及步骤S5，利用CDNA进行测序文库构建，得到RNA甲基化测序文库。
[0023] 进一步地，蛋白酶选择蛋白酶K、木瓜蛋白酶或者胃蛋白酶。
[0024] 进一步地，步骤Sl中，采用化学法对RNA进行片段化，得到片段化RNA。
[00巧]进一步地，片段化RNA的长度为50~20化t。
[0026] 进一步地，采用含化的盐溶液对RNA进行片段化。
[0027] 进一步地，含Zn2+的盐溶液中Zn2+的摩尔浓度为5~lOmol/L。
[002引进一步地，RNA甲基化特异性抗体为特异识别RNA中111吃、1^。、1115(：、11164^及111%中任一 种甲基化的抗体。
[0029] 进一步地，在步骤S4中，从消化物中提取RNA的步骤包括采用trizol和氯仿对消化 物进行抽提，得到上清RNA的步骤。
[0030] 进一步地，trizol和氯仿的体积比为4~6:1。
[0031 ]进一步地，从消化物中提取RNA的步骤在得到上清RNA的步骤后，还包括:用醋酸钢 和异丙醇对上清RNA进行沉淀过夜，得到提取的RNA。
[0032]应用本发明的技术方案，本发明的上述RNA甲基化文库构建方法，通过采用蛋白酶 直接将甲基化特异性抗体进行消化降解，使目的RNA片段从磁珠上解离下来。蛋白酶的消化 作用较类似物的竞争洗脱作用更强，因而可提高RNA的得率，且避免了甲基化位点类似物所 引入的噪音，提高了文库的构建质量，进而提高文库产出有效数据的利用率。
【附图说明】
[0033] 构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示 意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
[0034] 图1示出了根据现有技术及本发明的一种优选实施例中片段化后的RNA的长度比 较图。
【具体实施方式】
[0035] 需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可W相 互组合。下面将结合实施例来详细说明本发明。
[0036] 如【背景技术】部分所提到的，现有技术中基于免疫沉淀的RNA甲基化文库构建方法 存在噪音高导致文库质量相对较低的缺陷，为了改善运一缺陷，在本发明一种典型的实施 方式中，提供了一种RNA甲基化测序文库的构建方法，该构建方法包括:步骤Sl，对RNA样品 进行片段化，得到片段化RNA;步骤S2,利用RNA甲基化特异性抗体对片段化RNA进行免疫共 沉淀，得到沉淀物;步骤S3，利用蛋白酶对沉淀物进行消化，得到消化物;步骤S4，从消化物 中提取RNA并对提取的RNA进行逆转录，得到cDNA; W及步骤S5,利用CDNA进行测序文库构 建，得到RNA甲基化测序文库。
[0037] 现有技术中采用甲基化位点的类似物将目的RNA片段W竞争的方式进行洗脱存在 着W下=方面的缺陷：（1)制备甲基化类似物需要一定的成本和时间；（2)从原理上可知，竞 争关系为RNA上甲基化的碱基位点和该甲基化位点的类似物与同一种抗体的动态结合的平 衡，运就决定了无法使的抗体所结合的RNA全部置换下来；（3)类似物的引入会增加实验的 噪音，使得后续有效数据利用率大大降低。
[0038] 与现有技术相比，本发明的上述RNA甲基化文库构建方法，通过采用蛋白酶直接将 甲基化特异性抗体进行消化降解，使目的RNA片段从磁珠上解离下来。的消化作用较类似物 的竞争洗脱作用更强，且避免了甲基化位点类似物所引入的噪音，提高了文库的构建质量， 进而提高文库产出有效数据的利用率。
[0039] 上述构建方法中，对蛋白酶的具体种类并无特殊要求，只要能够将甲基化抗体蛋 白进行消化降解即可，因而任何能够实现上述功能的蛋白酶都适用于本发明。在本发明一 种优选的实施例中，上述蛋白酶选自蛋白酶K、木瓜蛋白酶或者胃蛋白酶。
[0040] 在上述步骤S3中，由于沉淀