专利名称：恢复细胞的甲基化状态的制作方法
技术领域：
本发明涉及改变细胞特征以及通过评价DNA甲基化标记监控改变的方法。
背景技术：
编码诸如动物(或植物)生物体所有基因产物的结构所需的所有信息都储存在四个脱氧核苷酸腺嘌呤(A)，鸟嘌呤(G)，胸腺嘧啶(T)或胞嘧啶(C)的其脱氧核糖核酸(DNA)的序列中。然而在DNA中存在第5种脱氧核苷酸，由一些C脱氧核苷酸复制后的甲基化(mC)作用产生，(Millar，D S.，Holiday，R.以及Grigg，W.2003，in；The Epigenome，eds，Beck，S以及Olek，A，WILEY VCH VerlagGmbH&Co Weinheim)。mC的一种功能是作为确定特定基因是否活化以及是否能转录从而产生基因产物的发育信号，(Li E.，1999，Nature Genetics，23，5-7；CoffignyH.等，1999，Cytogenetics and Cell Genetics，87，175-181)。通常，甲基化状态显示不同组织类型细胞基因的沉默，(Lunyak，V V.，2002，Science，298，1747-1752)并且未甲基化的状态显示基因激活，Moreau P.等，2003，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，100，1191-1196)。甲基化可以在完全成熟个体从受精卵开始的发育过程中在不同阶段依照遗传控制的模式改变配对的方式，(Monk M.，1995，Dev Genet.，17，188-197)。其发生的方式，原因以及如何控制这些过程还有待于发现。
在不同细胞类型的分化的成熟细胞中甲基化标记彼此不同。通常这些不同的甲基化标记在许多细胞分裂的过程中是相当稳定的但是在某种情况下可以被修饰。例如，DNA甲基化作用被认为是参与动物克隆的过程的一部分，其中来自成年人完全分化的细胞(诸如上皮细胞)的核被插入去核胚胎干细胞的细胞质中。上皮细胞核被改编程序以便利用胚胎干细胞细胞质的发育潜能。这个过程被认为是涉及上皮细胞核基因组的DNA甲基化作用标记的程序改编。通常认为上皮细胞核的异常后生程序改编是克隆低成功率的原因，(Pennisi，2001，Science，293，1064-1067；Dean W等，2001，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，98，13734-13738；Bourc′his，D等，Current Biology，11，1542-1546；Humphreys D等，2001，Science，293，95-97；Kang，Y-K.，2001，NatureGenetics，28，173-177；Mann MR W以及Bartolomei，M S.，2002，GenomeBiology，3，1003.1-1003.4)。基因组中正常甲基化标记的修饰对个体的健康常常是有害的并且对人类而言可以导致危急生命的疾病诸如癌症，(Jones，P A，1996，Cancer Research，56，2463-2467；Paz等，2003，Human Molecular Genetics，12，2209-2219；Baylin等，2001，Human Molecular Genetics，10，687-692；Wei等，2003，Ann N Y AcadSciences 983，243-250；Toyota等，2003，Proc.Natl.Acad Sci.USA，100，7818-7823)，以及多种其它的问题诸如神经系统紊乱，脆性X综合征等等，(Kriaucionis and Bird，2003，Human Molecular Genetics，12，R221-R227；Robertson，K D and Wolffe，A p，2000，Nature ReviewsGenetics，1，11-19；Esteller M，等，2002 Clinical Immunology，103，213-216；Feinberg，A P等，2002，Cancer Research，62，6784-6787)。这已经引起某些方法的临床应用，所述方法已知修饰组织培养中细胞的甲基化，诸如用抑制甲基化酶5-转甲基酶功能以及之后的DNA复制循环的5-氮胞苷或5氮脱氧胞嘧啶处理细胞，引起基因组中许多基因的普遍去甲基化，(Pietrobono R等，2002，Nucleic Acids Research，30，3278-3285)。虽然它在治疗某些类型的癌症中获得了有限的成功，但是同时也具有毒副作用。
迄今为止尚未证实可以对活细胞基因组进行选择性以及协调的去甲基化或甲基化特异性Cs。老年或者患病细胞以协调的方式程序改编甲基化状态以便恢复正常或年轻人的甲基化标记的目标还仅仅是梦想。
当个体细胞老化或者暴露于各种类型的环境干扰时，它们的基因组可以被损伤，(Richardson B，2003，Ageing Research Reviews，2，245-261；Nakajima，T.等人2001，Int J Cancer，94，208-211；Issa，JP 2003，in；The Epigenome，eds，Beck，S以及Olek，A，WILEY-VCH Verlag GmbH&Co Weinheim)。通常，这种损伤是可修复的。然而，修复过程发生差错引起细胞DNA中遗传密码的改变以及如果修饰限于四个编码核苷酸A，G，T或者C的一个或者其他四个的改变引起突变。然而如果修饰包括基因控制或者调节区5′甲基胞嘧啶(5mc)核苷酸标记的改变，如果特定的5mc被C取代可以引起基因表达的活化，如果C被5mC取代基因表达沉默。DNA损伤试剂诸如某些药物或者电离辐射可以在基因组中产生这种甲基胞嘧啶(mC)标记的修饰，(Nyce，JW，1997，Mutation Research，386，153-161)。此外，随着时间的推移，细胞在DNA肿聚集这种甲基化/去甲基化改变，这种聚集对以有害方式改变正常细胞功能具有影响。这可以引起老化个体疾病程度的增强或者具有这种损伤细胞的个体可能倾向于患诸如各种癌症的疾病。
本发明者已经设计了一种通用并且特异性定向程序改编细胞中的mC标记的方法，以便克服或者改变细胞中mC标记的聚集的异常甲基化改变的有害效应。
发明内容
第一方面，本发明提供了改变细胞特性或者状态的方法，包括如下步骤用能够改变细胞特性或者状态的试剂处理第一细胞型；以及通过测定处理的细胞基因组中的甲基化标记确定处理的细胞改变的程度，其中给定的甲基化标记显示处理细胞特性或者状态的改变。
第二方面，本发明提供了改变细胞特性或状态的方法，包括如下步骤
用来自具有期望特性或状态的第二细胞型的提取，裂解物或细胞组分在适宜的条件下以及时间段下处理具有非期望的特性或状态的第一细胞类型；以及通过测定细胞基因组内DNA甲基化标记确定处理细胞类型的改变程度，其中给定甲基化标记显示细胞中期望的特性或状态。
方法此外包括预处理第一细胞类型以使细胞能够渗透高分子。
所述方法还包括培养或培育处理的细胞以获得多拷贝的处理细胞。
第一细胞类型可以是任一人造血系统存在的细胞类型，(包括从出生到死后约48小时的细胞以及源自脐带，胎盘的细胞或来自上述细胞类型衍生物的细胞系的细胞)或任一其它取自人体别处并且改编程序变成造血系统的细胞。
术语细胞基因组内DNA甲基化标记被定义为人基因组区域内具有对应于特异性细胞型的特性甲基化标记的一组胞嘧啶。可以通过确定一种或者多种与一或多种基因组DNA区域相关的胞嘧啶的特异性甲基化分布图或模式确定给定细胞类型或细胞亚型中的标记。例如，标记可以是与DNA中一种或多种编码区相关的胞嘧啶甲基化模式。这种标记可以诊断例如CD14+单核细胞，或CD34+干细胞，或诸如老人或年轻人干细胞的细胞类型内的径迹。修饰的胞嘧啶的这种标记指示该细胞类型，不依赖于诸如细胞表面分子，细胞内蛋白质的组合，mRNA表达，代谢产物浓度，细胞的内含物，在不同微观水平(光或电子显微镜)确定的形态特征或上述组合的细胞类型特征。
优选地，第一细胞类型选自来源于患老化相关病，或诸如癌症的疾病，自身免疫病，(van Laar，J M and Tyndall，R，2003，Cancer Control，10，57-)，或诸如心肌梗死或者局部缺血的心血管问题(Perin E C等，2003，Circulation，107，2294-2302)的个体的细胞。更优选地，第一细胞类型为干细胞。然而应该理解可以处理其它细胞类型，诸如免疫以及造血系统的T细胞或单核细胞，(Abbas A K，2000，Cellular andMolecular Immunology，4 Edition，W B Saunders and Company；vonAdrian U H，等，2000，New Engl.J Med，343，1020-1034)，尤其是患病的细胞类型。
试剂可以是化学试剂，药物，核酸，适体，抗体，抗原，插入核酸(INA)，肽核酸(PNA)，锁核酸(LNA)，己糖醇核酸(HNA)，阿卓糖醇核酸(ANA)，环己基核酸(CNA)，寡核苷酸，修饰的寡核苷酸，单链DNA，RNA，蛋白，肽，其组合及其嵌合形式。
在优选的方案中，试剂是具有期望特性或状态的第二细胞类型的提取物，裂解物或细胞组分。
第二细胞类型可以源自任一种类或者种类组合，其中细胞DNA甲基化分布图是第一细胞类型改编程序的目的终点。优选地，第二细胞类型是来源于细胞类型类似于第一细胞类型的正常或健康的个体。更优选地，第二细胞类型是干细胞，(Orkin，S H，Zon，L I.，2002，NatureImmunology，3，323-328；Gage，F H.，and Verma，I M，2003，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，100，11817-11818；Prockop D J，等，2003，Proc Natl.Acad.Sci.USA，100，11917-11923)。第二细胞类型可以来自于患由第一细胞类型不希望的特性引起的病症或状态的亚成熟或个体。应该理解，诸如骨髓干细胞，其它的干细胞以及上皮细胞的其它细胞类型也可以用作第二细胞类型。
在一个优选的方案中，第一细胞类型以及第二细胞类型是来自相同种类的相同细胞类型。在另一个优选的方案中，第一细胞类型以及第二细胞类型不是相同的细胞类型或者不是相同的种类。第二细胞类型的实例包括但不限于两栖动物卵细胞或生殖细胞，用在人或其它哺乳动物第一型细胞上。
干细胞是指包括所有的成熟干细胞尤其是那些骨髓细胞系，(Verfaillie，CM.，2002，Nature Immunology，3，314-317；Orkin，S H.，Zon，L L，2002，Nature Immunology，3，323-328；Gage，F H.，和Verma，I M，2003，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，100，11817-11818；Prockop D J，等，2003，Proc Natl.Acad.Sci.USA，100，11917-11923)。
如果需要，第一细胞类型可以通过任一合适的方法处理以使其能够渗透大分子。处理包括但不限于电穿孔法，低温热休克或诸如链球菌溶血素O的酶。更优选地，治疗使得细胞可以瞬间渗透。
可以通过本领域公知的任一合适方法获得提取物，裂解物或细胞组分。实例包括但不限于Hakelien等描述的(2002)Nature Biotechnology20460-466。应该理解无细胞提取物可以进行进一步的处理或分馏以获得来自第二细胞类型的组分或高分子，当在第一细胞类型中时将改变第一细胞类型基因组内的DNA甲基化标记。
暴露时间可以从几分钟到几小时，取决于细胞类型，提取物，裂解物或细胞组分以及处理条件。可以在生理学温度或任一其它不会引起细胞死亡的温度下进行处理。
处理或改编程序的细胞可以在适于细胞生长以及分裂的条件下培养在本领域公知的任一合适的培养基或宿主中。本发明可以产生或选择通过其在其基因组DNA中的甲基化标记证实的具有所期望特性的稳定处理或改编程序的细胞。
宿主可以是动物，脊椎动物或无脊椎动物。当细胞适当地培养在宿主中时，可以通过已知的方法从宿主取出，从而使细胞保持完整。在一个优选的方案中，宿主为选自牛，绵羊，马，家禽或猪的家畜。
优选地，细胞基因组内的甲基化标记通过宿主内存在的可扩散因子进行确定。
甲基化标记优选地通过本领域已知的亚硫酸氢盐处理分析或本申请人开发的分析进行确定。
在优选的方案中，例如从老龄细胞到年轻状态的改编程序，成功处理的证明就是基因组的至少一部分或者全部的DNA甲基化标记被恢复成“正常的”年轻人的标记。也应该理解还可以仅仅一部分基因组DNA发生甲基化。
本发明的方法可用于提供第一细胞类型期望的特性或状态使得一种细胞亚型的DNA甲基化标记特性可以转换为另一个亚型的特性。例如，从一种淋巴细胞T细胞亚型到另一种淋巴细胞T细胞亚型，或老年造血干细胞可被修饰为年轻人造血干细胞。
或者，本发明的方法可用于提供混合种群内选择的细胞群期望的特性或状态。例如，如果具有混合种群的细胞，假定癌细胞以及正常细胞，细胞的混合种群可以通过本发明方法进行处理或靶向使得仅仅正常细胞被改变，响应以及分裂。通过确定处理细胞的DNA甲基化标记，可以证实标准电细胞已经适当地改变到具有预期效果。虽然未将癌细胞改变到正常，该方法可用于提高所期望的细胞类型的比例超高另一种的比例。
此外，在混合种群细胞中，诸如正常细胞以及癌细胞中，可被处理或改编程序进入休眠的或细胞凋亡或自杀状态。在两种细胞类型，或两种细胞亚型或多种细胞型或多细胞型的通常情况下，可以处理或改编任一型或亚型的程序以提供优于任一其它细胞型的竞争优势。
所述细胞可引起单一细胞类型的修饰甲基化标记的程序改编到相应相同细胞类型的正常细胞的标记(内部细胞类型改编程序)。
所述方法可用来程序改编老化细胞的甲基化标记到年轻人细胞的标记(Geiger，H以及Zant，G V.，2002，Nature Immunology，3，329-333)。例如，年长成熟干细胞的甲基化标记可被程序改编为年轻人干细胞的标记。患病干细胞基因组的甲基化标记可以被改变为正常干细胞，并且其它患病细胞，诸如免疫系统的T细胞的基因组的甲基化标记可被改变为非患病的T细胞。
干细胞可以为通过怀孕期间暴露于诸如化疗药物，或普遍的药物的药物，或损伤电磁辐射，或不充分供给诸如叶酸的标准化学试剂，DNA已经破坏的细胞，例如(Waterland R A and Jirtle，R L，2003，Molecular and Cellular Biology，23，5293-5300；Fenech M，2003；in；TheEpigenome，eds，Beck，S and Olek，A，WILEY-VCH Verlag GmbH&CoWeinheim)。
第三方面，本发明提供了根据本发明第一或第二方面的方法获得的分离改变或程序改变的细胞。
优选地，处理或程序改编的细胞为干细胞处理或改编程序的细胞可被用作用于随后处理的第二细胞类型，所述随后处理将排除获得来自进行一次处理的个体的新鲜的第二细胞类型的需要。处理或改编程序的细胞也可作为研究或其它医学应用诸如细胞治疗或移植的细胞系。
第四方面，本发明提供了处理患具有不希望的特性或状态的具有引起的病症的个体的方法，所述方法包括从个体获得细胞；在至少一些细胞上实施本发明第一或第二方面的方法，以获得具有期望特性或状态的处理或改编程序的细胞；以及将处理或改编程序的细胞返回个体，其中细胞繁殖并且取代至少一些具有不希望的特性的细胞以便治疗病症。
细胞可以是异种细胞群或给定的细胞类型。细胞可以是不希望的类型诸如癌症或期望的类型诸如正常细胞。
优选地，个体患诸如与老年或癌症或自身免疫病相关的疾病。
在优选的方案中，细胞为干细胞。处理或改编程序的干细胞可因此在受试者体内分化从而有助于处理。应该理解诸如癌细胞或与其它疾病相关的其它细胞类型也可以被处理。
本发明尤其是可用于恢复具有由于DNA甲基化标记的不希望的特性或状态的异常功能细胞的特性，所述DNA甲基化标记通过暴露于药物或更多随机事件由于老年相关过程已经修饰。
本发明的优点为，处理或改编程序后个体细胞返回(移植)给个体。因此，不应该存在排斥问题需要使用免疫抑制药物或药物治疗。
所述方法根据受试者以及条件可用于个体或人格化治疗。
已经可以瞬间渗透高分子的细胞可用相同表型的正常细胞的无细胞提取物，裂解物或细胞组分进行处理。这种细胞可以来源于处理的宿主个体或更优选地来源于从年轻个体细胞提取或获得的提取物，裂解物或细胞组分，所述年轻个体没有暴露于引起问题的相同的环境干扰(诸如老化)。
本发明也可通过只将第二细胞类型的提取物，裂解物或细胞组分用作获得可使人细胞通过新的途径从一种细胞类型到另一种细胞类型的分子特定组合的方式进行应用。总之，癌细胞高度非整倍体并且具有大概重排的基因组，因此一些基因高度扩增。此外，癌细胞不相应于任一已知的细胞类型因为每个癌细胞都可能是独一无二的。
因此它们可提供从中提取分子，假定高水平特定蛋白的提取物来源。此外，因为癌细胞常常含有染色体易位，它们常常具有融合基因产生新的蛋白产物。这些新的蛋白产物可用于以比利用来自现存正常细胞类型的提取物更好的方式处理或程序改编细胞。
同样地，许多生物体具有可用于从他们的细胞群获得新蛋白质或RNAs的这些目的的重排基因组。因此小鼠，突变小鼠，转基因小鼠，感染病毒的小鼠的株系都将具有独特地适于提取物的细胞群体。
同样大范围的果蝇突变体，C.elegans突变体，酵母突变体，E.coli突变体等等以及它们的转基因衍生物全部可提供在提取物中的新的基因产物，融合基因，获得功能突变的诸如新变体，新形式的小RNAs等等。这种不但来自自然进化谱而且来自庞大的突变菌株库的新蛋白质和RNAs的有效性，可通过本发明被利用。
在第五方面，本发明提供了根据治疗方法的第三方面的分离改变细胞的应用。
优选地，疗法是细胞治疗。
在第六个方面，本发明根据第三个方面的用于疗法的药物制备提供了分离改变细胞的应用。
在说明书全文中，除非上下文另有要求，术语“comprise”，或变化的形式诸如“comprises”或“comprising”，应被理解为包含所述元件的内含物，总体或步骤，或元件组，总体或步骤，而不排除任意其它的元件，总体或步骤，或元件组，总体或步骤。
包含在本申请说明书论述中的任一文献，作用，原料，装置，商品等等仅仅是为了提供本发明背景的目的。其不应因为其在此申请的各权利要求的优先权日期之前已存在于澳大利亚而被认为任意或所有的这些物质构成现有技术基础的一部分或是与本发明有关的公知常识。
为了更清楚地理解本发明，以下参考下列的图和实施例描述优选的方案。
附图的简要描述
图1显示了分离自成人外周血液干细胞的总RNA的琼脂糖凝胶电泳分离，以便在Affymetrix微阵列平台分析之前测定RNA的高的质量。泳道M表示分子量标记。泳道SE488和泳道SE489表示来自两个个体的。两个显著的条带表示18S和28S核糖体RNA。
图2表示进一步加工之前RNeasy纯化样品来测定RNA质量的琼脂糖凝胶电泳分离。泳道M表示分子量标记。泳道SE488表示RNA来自一个来自两个个体的混合物。两个显著的条带表示18S和28S核糖体RNA。结果与高质量的RNA一致。
图3表示纯化cRNA的琼脂糖凝胶电泳分离。泳道M表示分子量标记。泳道SE488表示cRNA来自一个来自两个个体的混合物(SE-488)。
图4表明通过琼脂糖凝胶电泳证实了cRNA的片段化。泳道M表示分子量标记。泳道SE488表明片段化的cRNA来自一个两个个体的混合物。
图5显示利用Atlas 8K微阵列对年轻干细胞与老的干细胞的表达分布图进行的微阵列分析。每个阵列上的探针用于与来自人基因的转录本杂交且每个探针被点样两次，因此为双联体斑点。来自细胞群体的放射性-标记的RNA杂交于阵列且双联体斑点的信号强度表示这些特定细胞类型中的特定基因的表达水平。
图6表示来自人基因组区域的DNA序列，其停泊七个称为ABCB1，IRF7，ESR1B，GZMA，CDX1，MAGEA2和THY1的选择位点且通过由改编程序之前和改编程序之后的细胞提取的DNA的亚硫酸氢盐修饰后进行DNA测序测定它们的甲基化状况。第一细胞类型(待处理或改编程序的细胞)表示任一处理之前的细胞类型。第二细胞类型表示第一细胞类型需要转变为的目的终点细胞。“Reprog”，表示来自已用第二细胞类型的提取物处理的细胞的基因组DNA的甲基化状况。DNA水平的变化是处理的结果。
本发明的实施方式方法细胞甲基化标记的测定DNA的亚硫酸氢盐处理2μg的DNA，其如果期望可用合适的限制性内切酶预降解，2μl(1/10体积)的3M NaOH(6g在50ml水中，新近制备)添加到20μl的终体积中。混合物在37℃温育15分钟。在高于室温的温度下温育可用于增加变性作用的效率。
温育之后，连续添加208μl的2M焦亚硫酸钠(7.6g在具有416ml10N NaOH的20ml水中；BDH AnalaR#10356.4D；新近制备)以及12μl的10mM对苯二酚(0.055g在50ml水中，BDH#103122E；新近制备)。样品用200μl的矿物油覆盖。然后55℃温育样品过夜。任选地，样品可在热循环仪中进行如下循环温育约4小时或如下过夜步骤1，PCR仪中55℃/2hr；步骤2，95℃/2分钟。步骤1可在从约37℃至约90℃的任一温度下进行且在5分钟到8小时的时间范围内变化。步骤2可在从约70℃至约99℃的任意温度下进行且在约1秒钟至60分钟或更长的时间范围内变化。
用焦亚硫酸钠处理之后，除去油，并添加1μl的tRNA(20mg/ml)或2μl糖原，如果DNA浓度较低。这些添加的成分是任选的且可用于增加通过与靶向DNA共-沉淀获得的DNA的产量，尤其当DNA以低浓度存在时。
如下进行清除异丙醇的处理将800μl的水添加到样品中，混合然后添加1ml的异丙醇。样品再次混合并在-20℃维持至少5分钟。在离心机中旋转10-15分钟并用80％ETOH，冲洗颗粒两次，各涡流一次。此洗涤处理除去任意的与核酸形成沉淀的残留的盐。
颗粒进行干燥然后再悬浮在合适体积诸如50μl的T/E(10mM Tris/0.1mM EDTA)pH7.0-12.5中。缓冲液在pH 10.5处已被认为是尤其有效的。样品在37℃至95℃下温育1分钟至96hr，根据需要悬浮核酸。
用1μl的处理的DNA进行PCR扩增。对含有1μl亚硫酸氢盐-处理的基因组DNA的25μl反应混合物进行PCR扩增，利用Promega PCR主要混合物，6ng/μl的每一引物。1μl的1st循环扩增产物被转入含有引物的第二循环扩增反应混合物中。在Clark等.Nucleic Acids Res.1994Aug 11；22(15)2990-7中描述的条件下利用ThermoHybaid PX2热循环仪扩增PCR产物的样品。
在每50μl琼脂糖含有1滴溴化乙锭(CLP#5450)的1％TAE中制备琼脂糖凝胶(2％)。将5μl的PCR产物与1μl的5X琼脂糖装载缓冲液混合并在X1TAE中利用水下水平的电泳槽以125mA进行电泳。标记是低的100-1000bp类型。
凝胶在UV照射下利用Kodak UVldoc EDAS 290系统显像。
处理或改编程序方法用于制备提取物的第二细胞类型即Jurkat T-细胞系(1×滚瓶1,700cm2)待处理或改编程序的第一细胞类型即293T成纤维细胞(改编程序之前已分开的2×T75瓶)。
细胞DMEM生长培养基胰蛋白酶/EDTA(0.25％)细胞裂解缓冲液即50mM NaCl，5mM MgCl2，20mM Hepes pH8.2的碱溶液可冷冻贮存为50ml等分。随后的缓冲液添加成分为PMSF(100mM原料的ETOH溶液)，DTT(1M原料)和蛋白酶抑制剂混合物，等分试样并冷冻(Sigma P8340)。
链球菌溶血素O(Sigma S0149)原料等分试样并以65单位/l冷冻在H2O中(冷冻原料在1个月后应丢弃)。
HBSS(Hanks平衡盐溶液，无-Ca2+)1×500ml瓶的PBS(无-Ca2+/Mg2+)200mM CaCl2ATP(200mM原料的水溶液)GTP(10mM原料的水溶液)磷酸肌酸(2M原料的水溶液)肌酸激酶(5mg/ml原料的水溶液)核苷酸(NTP)混合物(ATP，GTP，CTP，UTP；各100mM)葡聚糖，德克萨斯红(分子探针D-1830)25mg/ml的水溶液。
具有3mm触点的探针超声波仪细胞培养多-孔平皿(48孔)一次性的50ml，15ml，1.5ml和0.2ml试管(无菌的)4℃离心*用swing-out buckets对1.5ml试管离心*通过15000g自旋对1.5ml试管进行离心*以800g对15ml和50ml试管离心载玻片和盖玻片Cell Chamber玻片37℃水浴标准共焦显微镜具有绿荧光过滤器的落射荧光(Epifluorescence)显微镜提取物的制备I.收集第二细胞类型Jurkat T-细胞系并转入50ml试管中，4℃下800g旋转(～1200rpm)10分钟II.在冷的1×PBS中冲洗细胞2次，4℃下800g旋转10分钟。在第一次冲洗过程中将细胞收集到一个具有刻度线的15ml试管中。当进行第二次冲洗时取出一个小的等分试样用于细胞计数。
III.在10ml添加下述成分的冰冷细胞溶解缓冲液中冲洗细胞颗粒1×1μl的1M DTT/ml的缓冲液和10μl的100M PMSF/ml的缓冲液。
IV.4℃下800g旋转10分钟。添加裂解缓冲液后保持在冰上是很重要的。
V.估计细胞颗粒的体积并将颗粒再悬浮在稍微小于1×体积的具有DTT，PMSF和蛋白酶抑制剂混合物的裂解缓冲液(10μl混合物/ml缓冲液)中。
*注意细胞悬液非常浓；力求不引入气泡。
利用移液管来观察是否最终的体积为2x细胞颗粒以及是否不用加入更多的缓冲液。不要稀释细胞颗粒超过2x的最初颗粒体积。
VI.保持在冰上45分钟使细胞溶胀。
VII.将细胞等分200μl到1.5ml试管中。超声波处理直到所有的细胞和细胞核裂解(在显微镜下检查)。35％功率，0,4s间隔，大约1分15秒每试管。(针对每一细胞类型的超声波条件已被优化)VIII.将裂解物集中到1.5ml试管中，在4℃15000g旋转15分钟。
IX.去除上层清液(提取物)以及保留3×20μl等分试样的提取物用于测定蛋白浓度，pH和毒性。将残余物等分到200μl-PCR管中，使其为100μl提取物/试管。
X.利用提取物直接或快速在液氮或干冰和ETOH中冷冻并-80℃贮存。
细胞处理或改编程序I.收集目的293T成纤维细胞(第一细胞类型)并在冷1×PBS中冲洗2x。冲洗过程中保持细胞冷却。在第二次冲洗过程中取出一等分试样进行计数。测定细胞数量。
II.在冷HBSS中冲洗细胞1x。
III.再悬浮细胞在1.5ml管中产生用于各反应的20,000细胞/100μl HBSS的浓度。由于在5x的各反应中的细胞数很低，因此当混合到最终的平皿孔中时每孔将有100,000个细胞。这个也用作对照。
IV.4℃下在swing-out bucket旋转器中1200rpm旋转5分钟V.移去上清液(注意不要除去细胞)VI.向各管中添加15.5μl HBSS。
VII.制备SLO作用溶液解冻原料的等分试样(65.8单位/μl)，保持在冰上。在HBSS中1∶100稀释。一直保持在冰上VIII.将管放置在37℃的水浴中。添加SLO之前预热样品几分钟。
IX.添加4.5μl SLO/管(1∶100稀释，产生2.9单位的最终SLO浓度)，轻弹管来混合SLO与细胞悬浮液。
X.37℃温育50分钟，XI.制备用于改编程序的提取物
→通过以1∶1∶1∶1的比率混合ATP，GTP，肌氨酸激酶，磷酸肌酸原料来制备ATP生成系统(原料可维持在-20℃)。
25mM可被冷冻的原料，一旦解冻继续维持在冰上，被以1∶1∶1∶1的比例混合来产生100mM NTPs。
XII.对各100μl的提取物来说需要添加51的上述新近混合的ATP生成系统和4μl的NTP混合物。保持提取物在冰上直到使用。
XIII.放置管(具有细胞在SLO中)在冰上并添加200μl的冰冷HBSS到各管中(来终止SLO反应)。在swing-out bucket旋转器中4℃1200rpm旋转5分钟。将管放回在冰上。
XIV.除去上层清液。注意不要移去细胞。
XV.添加20μl提取混合物/管的细胞(或20μlHBSS与德克萨斯红葡聚糖来用于吸收调节)XVI.轻弹管进行混合。在37℃(水浴)温育1小时。转移管到管架(室温)并添加具有2mM CaCl2的培养基。
XVII.转移细胞到多孔细胞培养平皿中，收集5个反应到一个孔中。
XVIII.在CO2培养箱中温育细胞2小时。
XIX.用常规的培养基替换CaCl2培养基并放置过夜。
成年个体的表达分布图微阵列分布方法；幼年和成年个体干细胞的表达分布图利用标准的G-CSF规程将成人CD34+干细胞输入到外围血流中(Filgrastim；de al Rubia等，2002，Transfusion，42，4-9)，广泛应用的，(Anderlini P等.，1997，Transfusion，37，507-512；Kang，E M.，2002，Blood，99，850-855)，通过标准的白细胞分离法收集CD34+细胞以及通过标准的磁珠技术分离CD34+干细胞(健康的第一细胞类型)，(Dynal)。冷冻细胞直到使用并通过标准方法提取RNA。RNA被适当地转化，标记，与微振列平台杂交以及通过适当的激光扫描或通过放射性检测方法推断RNA的表达水平。产生数据的Bioinformatic分析提供了基因组的相对基因活性的瞬态图，用Affymetrix平台，U133A在平台上具有超过20，000个充分注释的人基因，(或部分基因)。
利用Atlas塑料8K阵列规程对人CD34+造血干细胞进行微振列分析纯化取自49岁男性患者的CD34+造血干细胞纯化来自全血的CD34+细胞样品获自悉尼皇家北岸医院(Royal North Shore Hospital)的遭受重度白血病的患者。获取样品前得到了道德委员会的批准。利用FicollPaque plus(Amersham Biosciences#17-1440-03；Piscataway NJ)按照生产商的说明收集白血球。分别按照生产商的说明由白血球群体CD34祖细胞选择系统(Dynal#113.01)分离CD34+细胞。
Atlas RNA提取方法I.将1ml的Trizol直接添加到磁珠/细胞复合物中并将样品-70℃储存。
II.将样品由-70℃取出并在冰上解冻。
III.充分混合样品并在室温下放置5分钟来分离核蛋白复合物。
IV.将0.5ml的磁珠/细胞移至干净的无RNase的1.5ml离心管中并将管置于磁性分离机上60秒以及将无磁珠的上清液移至干净的管中。
V.然后在4℃下12000Xg旋转10分钟来除去高分子量的DNA及其它杂质。
VI.将上清液移至干净的管中并加入100μl的100％氯仿，手工强烈混合样品15秒然后室温下温育2-3分钟。
VII.然后在4℃12000Xg旋转样品10分钟来分离相。
VIII.上层水相被移至干净的管中确保移液管末端远离接触面并添加1μ1的20mg/ml糖原以及涡流样品。
IX.添加等体积的100％(0.25ml)至涡流的管中然后室温放置10分钟。
X.然后在4℃12,000xg旋转样品10分钟使RNA颗粒化。
XI.除去上清液并用0.75ml的80％乙醇冲洗以除去DNA合成反应的抑制剂，简单地涡流然后在4℃下7,500Xg旋转5分钟来使RNA颗粒化。
XII.重复步骤11一次。
XIII.颗粒然后在微离心机中旋转10秒除去残留的乙醇且将颗粒立即再悬浮在25μl的无RNase的水中。
注意，如果颗粒变干则很难再悬浮RNA且260/280比率将小于1.6。
XIV.然后记录OD 260/280/310。
cDNA合成I.制备下述的试剂用于的0.5ml无RNase薄壁管中的各cDNA合成反应。
添加的μlCD34+细胞 T-细胞 对照RNARNA 3.5(200ng)1(243ng)1(1000ng)cDNA引物(10μM) 1 1 1SMART Oligo(10μM)1 1 1去离子水2.5 2.5II.混合内容物并在微离心机中短暂地旋转。
III.样品在70℃温育8分钟使RNA变性。
IV.当RNA被变性时，制备下述的主要混合物添加的μl每反应 3.5反应5x第一链缓冲液2 7DTT(20mM) 1 3.550x dNTP混合物1 3.5总体积4μl14μlV.从PCR仪中取出管并在冰上冷却2分钟然后短暂地旋转收集内容物。
Vl.然后在42℃下温育样品持续2分钟。
VII.每反应中添加0.5μl的Powerscript逆转录酶(1.75μl)并通过移液管充分混合主要的混合物。
VIII.4.5μl的完全主要混合物被添加到各样品和对照管中且然后42℃温育样品60分钟然后转至冰上。
IX.40μl的10mM Tris/1mM EDTA pH7.6被添加给各样品。
X.72℃加热管7分钟然后-70℃贮存直到使用。
通过长距离PCR进行Atlas cDNA扩增注意应确定各样品的循环数以确保反应不会停滞不前。针对各样品一式三份(2个试验和1个对照)进行扩增反应且对照胎盘(placenta)为一式两份(1个试验和1个对照)。
I.热循环仪预热到95℃。
II.在0.5ml薄壁管中，将5μl的第一链cDNA与37μl的去离子水混合。
III.制备下列主要的混合物每rxn 8.5rxn10x PCR缓冲液 5μl42.5μl50X dNTP混合物(10mM) 1μl8.5μlPCR引物(10μM) 1μl8.5μl优势聚合酶 1μl8.5μlPCR混合物总体积8μl68μlIV.涡流主要混合物然后在微离心机中短暂地旋转。
V.8μl的混合物添加到合适的管中并通过移液管充分混合样品。
VI.用55μl的矿物油覆盖管。
VII.开始如下的热循环Hybaid PCR仪95℃1分钟x循95℃15秒65℃30秒68℃3分钟VIII.所有的管如上所述进行15个循环的PCR然后除去试验样品(即x2CD34+/x2T-细胞/x1对照)且将这些管置于冰上。
IX.10μl的各对照样品移至干净的管中且残余混合物如上所述进行另外的三个PCR循环。
X.步骤9重复另外的两次来产生最终24个循环的PCR。
XI.在1.2％琼脂糖凝胶上利用1kb DNA大小的标记分析这些样品。
Atlas旋转柱纯化PCR产物注意利用Nucleospin系统而不是Chroma旋转系统。
I.28ml的95％乙醇被添加到缓冲液NT3中。
II.用50μl的TE缓冲液pH 7.5调整PCR产物的体积为100μl并通过移液管充分混合样品。
III.400μl的NT2缓冲液被添加到样品并充分混合样品。
IV.将Nucleospin柱置入2μl收集管中并将样品吸取到过滤器上。然后14,000rpm离心样品1分钟并丢弃收集管。
V.将柱放置在新收集管中并添加500μl的缓冲液NT3。然后14,000rpm离心样品1分钟并丢弃收集管。
VI.重复步骤5两次。
VII.将柱置入新的收集管中且然后14,000rpm离心样品1分钟以除去残留的乙醇。
VIII.将柱置入干净的1.5ml离心管中并直接添加50μl的缓冲液NE到过滤器上(注意确保移液管不接触过滤器表面)。
IX.浸润样品2分钟然后14,000rpm离心1分钟来洗脱纯化的PCR片段。
X.测定OD260/280/310。
Atlas旋转柱纯化T-细胞PCR产物#2注意重复纯化以增加PCR产物的产率。
1.用50μl的pH 7.5TE缓冲液将PCR产物的体积调整到100μl并通过移液管充分混合混合物。
II.将400μl的NT2缓冲液添加到样品中并充分混合混合物。
III.将Nucleospin柱放置在2ml收集管中并将样品移取到过滤器上。然后14,000rpm离心样品1分钟并丢弃收集管。
IV.将柱置入新的收集管中并添加NT3缓冲液500μl。然后14,000rpm离心样品1分钟并丢弃收集管。
V.重复步骤IV额外的两次。
VI.将柱置入新的收集管中且然后14,000rpm离心样品1分钟以除去残留的乙醇。
VII.将柱置入干净的1.5ml离心管中并将50μl的缓冲液NE直接地添加到过滤器中(注意确保移液管不接触过滤器表面)。
VIII.浸润样品2分钟然后14,000rpm离心1分钟来洗脱纯化的PCR片段。
IX.测定OD260/280/310。
Atlas SMART cDNA探针标记I.需要标记500ng的各样品以产生合适的探针。注意探针的最终特异性活性应为107。
II.预热热循环仪至97℃。
III.在单独的0.5ml薄壁管中添加1μl的随机引物混合物以及适当体积的PCR产物和去离子水(参见下文)。
CD34+T-细胞 对照纯化的PCR产物23μl18.9μl 11.9μl去离子水 10μl14.4μl 21.1μlIV.样品在97℃变性8分钟V.当样品变性时制备下列的主要混合物
CD34+/T-细胞 对照10x标记缓冲液 11μl10x标记缓冲液 5.5μl用于dA的10x dNTP混合物11μl用于dA的10x dNTP混合物 5.5μl33P-dATP 11μl33P-dATP 5.5μl混合物总体积 33μl16.5μlVI.变性后通过移液管和短暂地旋转管充分混合样品。
Vll.将热循环仪温度降至50℃，50℃温育管3分钟。
VIII.向每一反应的主要混合物中添加1μl的克列诺酶并通过移液管充分混合。
IX.温育后将16μl的主要混合物添加到合适的管中，混合内容物并将样品立即放回热循环仪。
X.50℃下温育管30分钟并通过添加2μl的0.5M EDTA终止反应。
Atlas旋转柱纯化33P-dATP PCR产物1.将NT2缓冲液(350μl的缓冲液)添加到终体积为400μl的样品中并充分混合样品。
II.将Nucleospin柱置入2ml收集管中并将样品移取到过滤器上。然后14,000rpm离心样品1分钟并丢弃收集管。
III.将柱置入新的收集管中并添加350μl的缓冲液NT3。然后14,000rpm离心样品1分钟并丢弃收集管。
IV.重复步骤3额外的两次。
V.将柱置入干净的1.5ml离心管中并将100μl的NE缓冲液直接添加到过滤器上(注意确保移液管不接触过滤器表面)。
VI.浸润样品2分钟，然后14,000rpm离心1分钟来洗脱纯化的PCR片段。
VII.测定纯化探针的CPM。
VIII.将2μl的纯化物质添加到5ml的闪烁体上并记录32P通道上的CPM。
Atlas阵列杂交I.杂交瓶装有80％的去离子水并加热至60℃。同时在50ml的falcon管中将2×25ml的plastichyb升温至60℃。
II.将阵列置于预升温的温水中，且使其印刷侧面(非-发光)向里。
III.将10ml的plastichyb(x2)置于新的容器中。50μl的20xSSC与50μl的剧烈阻断试剂结合并95℃加热5分钟然后在冰上维持两分钟急速冷却。此溶液然后与plastichyb结合。
IV.排干阵列中的水并添加plastichyb以及在60℃预杂交阵列30分钟。
V.50μl的20xSSC与50μl的剧烈阻断试剂结合并添加于纯化的探针。煮沸探针10分钟并在冰上冷却2分钟。
VI.上述溶液与剩余的2×15ml的plastichyb结合，彻底地混合溶液，丢弃prehyb并将杂交溶液添加到合适的瓶中。
VII.阵列在60℃杂交过夜，确保它们水平的恒定。
Atlas冲洗和曝光I.杂交溶液被丢弃在50ml falcon管中并用预加温的(60℃)高盐缓冲液(2xSSC/0.1xSDS)装满80％的杂交瓶以及在58℃温育样品5分钟来除去残留的辐射。
II.除去冲洗缓冲液并重复步骤I。
III.用低盐冲洗缓冲液(0.1xSSC/0.1％SDS)装满80％的瓶并在58℃温育阵列5分钟。
IV.重复步骤III一次。
V.杂交恒温箱温度降低至30℃并用室温的低盐缓冲液再次装满80％的瓶并温育另外的5分钟。
VI.然后将阵列由杂交瓶移至500ml的装有低盐冲洗缓冲液的烧杯中。
VII.阵列在烧杯通过浸洗冲洗若干次然后最后非常缓慢地移出确保没有大的液滴粘附在阵列表面。
VIII.彻底风干阵列，向内部粘入荧光体盒并将筛子直接与阵列接触。阵列在第1天和第7天暴光。
来自不同年龄个体的干细胞的Affymetrix微阵列分析用Affymetrix基因芯片阵列进行基因-表达分析获得的支持本发明的数据包括来自在独立微阵列平台上进行基因表达分析的。利用Affymetrix基因芯片技术进行基因表达分析。具体的信息，参见Affymetrix网页(www.affymetrix.com)。
RNA分离和纯化方法，cRNA合成和片段化，杂交，染色，阵列扫描的所有步骤-已利用设备和Affymetrix建议的规程来进行。数据分析的软件为Microarray Suite 5.0(Affymetrix)。关于统计算法的详细信息可在Affymetrix网页中找到(www.affymetrix.com)。
Affymetrix样品处理由包含在RNAlater中的细胞样品开始进行基因-表达分析。这些样品的内部处理编码显示在下述表1中。
表1
用TRlzol试剂(Life Technologies)按照生产商的说明书分离总RNA。将各样品再悬浮在22μl的无RNase的水中。通过琼脂糖凝胶电泳分析级分(图1)。
纯化之前混合二样品且混合物称为SE488。
用RNeasy试剂盒(Quiagen)进行纯化。RNA在35μl的无RNase的水中洗脱，并在快速真空仪上浓缩至终体积为12μl。通过光度计和琼脂糖凝胶电泳检验纯化RNA的量和质量(图2)。
生物素标记cRNA的Affymetrix合成由纯化的总RNA开始，利用SuperScript选择系统试剂盒(Teehnologies)按照Affymetrix表达分析技术操作指南来合成cDNA。通过Enzo BioArray HighYield RNA Transcript Labeling(T7)试剂盒由cDNA合成cRNA a用Affymetrix GeneChip样品Cleanup Moduke试剂盒纯化cRNA并在22μl的无RNase水中洗脱(图3和表2)。
纯化cRNA的浓度和纯度。高纯度RNA应具有＞1.9的OD值。因此来自集中样本的RNA进一步处理具有充分的纯度。
表2
纯化的cRNA在阵列上杂交之前被片段化(图4)。
Affymetrix U133A阵列的杂交和扫描-对照的分析用于评价杂交混合物质量的两个基本参数峰值对照的存在，和管家基因的3′/5′比率。
峰值对照为包含在杂交混合物中的对照寡核苷酸。通过扫描检测这些寡核苷酸表明杂交，冲洗，染色和扫描步骤正确地进行。所使用的峰值对照为BioB，BioC，BioD和Cre。BioB为在混合物中具有最低分子数的峰值对照，此特点使其成为评价试验敏感性的优选对照。
管家对照为在所有组织以及在任何情况下组成型表达的基因的探针。阵列上的probes被设计与管家基因的3′，中间和5′区域杂交。3′/5′比率是合成的cRNA的完整性的指标，其反过来反映最初RNA的完整性。因此，3′/5′比率为1是指起始RNA和合成cRNA的总完整性。此比率变化取决于来源组织和RNA处理的条件。Affymetrix建议使用具有3′/5′比率＜3的RNA制备物。
管家基因的组成型表达因组织以及实验条件的不同而变化，如文献中所反映的。
Affymetrix强烈地建议GAPDH作为正确的管家基因。
表3.来自样品SE488的GAPDH3′/5′比率和BioB峰值对照值。
选择典型的基因用于甲基化分析。应注意到现在没有高通量的技术来直接地测定全部人基因组的基因组-广泛的甲基化状况，(此方法处于初期；Adorjan等，2002，Nucleic Acids Research，30，e21；Yan PS等，2000，Clinical Cancer Research，6，1432-1438)；Gitan RS等，2001，Genome Research，12，158-164)，且因此原因我们在RNA表达分布图的基础上对老化基因组应用了最初的过滤。
来自Atlas和Affymetrix基因表达分布图的组合数据分析利用Affymetrix和Atlas平台进行微阵列分析测定老化细胞中上调和下调的基因的实例。这些表达分布图提供了在年轻和老化干细胞群体中活性的基因组-广泛的分析因此产生了老化过程中重要基因的概念。这样的基因然后进行甲基化分析来证实老化细胞的最优改编程序-恢复为年轻的表现型(参见图6的如何进行此种分析的详述)。
老化过程中活性显著改变的一些基因显示在表4中。
利用Affymetrix和Atlas平台进行微阵列分析测定的老化细胞中上调和下调基因的实例显示在表4中。这些表达分布图提供了在年轻和老化干细胞群体中mRNA活性基因组-广泛分析并提供了在老化过程中变化的重要基因的测定。然后选择这样的基因区域用于DNA甲基化分析且随后用于证实老化细胞的改编程序恢复为年轻表现型。
表4
结果改编程序本领域的技术人员应能理解处理或改编程序以及随后特定成人干细胞的移植需要满足严格的伦理原则和不同国家的广泛法律的全面要求。此外，技术上的阻碍为成人造血干细胞离体细胞分裂较少。干细胞需要活体内移植到相同的个体，其中它们靶向骨髓并进行细胞分裂。因此假定成年人干细胞改编程序的DNA甲基化状态的在大量的活体内细胞分裂过程中稳定地遗传的原则性证据，具有大量来自伦理和技术上的目前难以克服的障碍。我们因此提供了不同人系统中稳定的遗传甲基化变化的原则性证据，所述人系统利用其中成纤维细胞甲基化状态被改编程序为免疫系统T细胞的甲基化状态的细胞。
选择老化过程中改变的基因为测定老化过程中DNA甲基化特征变化的基因，我们根据表达分布图的变化建立了最初的分子过滤器，(基因的RNA表达水平)。因为，通常，增加甲基化导致基因活性的关闭，而脱甲基化导致基因活性的增加，我们已进行研究来发现其活性在老化过程中变化的基因。对本领域的技术人员而言，我们利用来自不同老化个体的流动外周血液中的成人CD34+干细胞，从他们的早20岁到它们的晚60岁变化，(de la Rubia，J.，等，2002，Transfusion 42，4-9)。我们利用商业的Affymetrix微阵列，(www.affymetrix.com)，以及其它的商业平台，Atlas，用于测定青年和老年个体之间改变的RNA表达分布图。我们选择了其表达水平在老化过程中下调或上调的基因。此种选择后，可测定合适的调控或基因对照区域的甲基化状况。
第一细胞类型(成纤维细胞)和第二细胞类型(T细胞)采取具有特定的DNA甲基化标记基因组的成纤维细胞并且将细胞暴露于来源于细胞系的T细胞或来自健康个体外围血液的T细胞一段时间。将细胞转移到新鲜培养基中并且允许细胞进行多次细胞分裂。监控改编程序细胞的变化的表型状况，其中改编程序细胞分子修饰由成纤维细胞的变化为T细胞的，(细胞表面分子提供了对表型状况的操作)。由细胞分离基因组DNA并测定基因组的甲基化标记，将其与第一细胞类型和第二细胞类型基因组的进行比较。
血液来源的干细胞得到合适的伦理许可后，对于干细胞改编程序应用类似的操作。
从老年的第一细胞类型或其已经用DNA损伤剂处理的第一细胞类型采集血液来源的骨髓干细胞。这些干细胞已显示出在他们的基因组中具有破坏的甲基胞嘧啶(MC)标记。将细胞暴露于获自年轻健康的第二细胞类型的干细胞样品的无细胞提取物一段时间(几分钟到几小时)，然后转移暴露的细胞到新鲜培养基中并在将处理的干细胞转移回具有损伤干细胞的宿主之前温育细胞一段时间。
第一细胞类型表示任一改编程序治疗之前的细胞类型。第二细胞类型表示第一细胞类型需要移向的目的细胞。“改编程序的”表示已经用来自第二细胞类型的裂解物，提取物或化合物处理的细胞，且其目前处于沿着由第一细胞类型到第二细胞类型的特征的径迹的某处。
细胞类型。在人类有至少300个细胞类型来自在前的受精作用且根据在光学显微镜下的形态被传统定义。因此造血系统的成员，诸如嗜碱性白细胞，嗜中性粒细胞，嗜酸性粒细胞，巨核细胞和血小板彼此之间或与内皮细胞，皮肤细胞，和神经系统细胞诸如神经元和胶质细胞之间很容易被区分。细胞类型的分子分类学显示识别细胞表面蛋白质和/或细胞内部的蛋白质的抗体允许在细胞类型之间被精细地区别。利用微阵列-型技术的基因表达分布图，(其测定细胞内mRNA分子的数量和类型)，还可以用于产生细胞类型之间的区别。
由一种细胞类型到另一种的改编程序。细胞类型是可利用适当的方法互相转换的，(第一细胞类型可被改编程序为第二细胞类型)。在现有技术中所有这些改编程序的不清楚之处在于是否可利用的细胞标记是充分稳定的以及足以显示是否改编程序细胞具有由第一细胞类型到第二细胞类型的彻底转变，是否其仅仅部分地改编程序，是否改编程序是稳定的，或是否用于改编程序的方法引入了损害改编程序细胞在其新环境中的正常行使功能的能力的不需要的变化。关于改编程序细胞的确切知识在为干细胞改编程序情况下是特别关键的，因为干细胞是许多随后细胞类型的组细胞。此外，在现有技术用于描述细胞类型的标记，诸如mRNA或蛋白，可能仅仅被短暂表达。相反，本发明人发现了甲基化标记是变化的稳定指示剂，当然在时间框架内被认为是。
不同细胞类型基因组的甲基化特性。本发明涉及我们所称的“细胞径迹”。这些径迹由一个细胞类型通向另一种类型(第一细胞类型到第二细胞类型)且测定沿着改编程序细胞群体位于的径迹的距离。本发明人利用来自改编程序细胞的基因组区域的甲基化标记来测定改编程序细胞在径迹上的位置。例如，人基因组中1000个核苷酸的DNA片段具有大量的胞嘧啶，每一个可能以甲基化(M)或未甲基化的(u)状态存在。在第一细胞类型中的胞嘧啶可能是MMMMM，而在第二细胞类型中可能是uMuMu。这些特性标记对于每一细胞类型而言是独特和稳定的，因此可测定正在被由第一细胞类型改编程序为第二细胞类型的细胞是否事实上已成为期望的第二细胞类型，或是否其仅仅部分地沿着径迹。因此，如果改编程序细胞具有uMuMu的一个甲基化标记然后其成为第二细胞类型。如果，然而，处理的细胞是uMMMu然后其仅仅部分地沿着径迹。然而，如果是uuuMu然后存在一个问题，因为第二位置已达到新的状态也就是说第一细胞类型或第二细胞类型中不存在的状态。
标记的水平。选择的基因组甲基化标记显示其中沿着改编程序细胞位于任一特定时间的径迹的位置，可被描述在许多水平上。例如，可使用在基因组的编码或非编码区的DNA的连续延伸。任选地，可使用来自基因组不同部分的DNA的延伸，来自23对染色体的每一对的延伸，或来自单一染色体的多重延伸。
我们通过利用在7个基因(称为ABCB1，IRF7，ESR1 B，GZMA，CDX1，MAGEA2和THY1)附近的DNA的延伸举例说明了本发明的数据，且仅仅这些邻接于鸟嘌呤的胞嘧啶，也即CG双联体被使用。
DNA甲基化标记优于任一其它沿着细胞径迹距离的指示剂。现有技术中分子细胞类型的定义是不精确的，因为如果抗体被用于抗细胞表面蛋白，也许发现，例如T细胞受体复合物存在于细胞的表面上，但是存在不充分的其它蛋白种类来将那些细胞分类作为免疫系统的功能性T细胞。同样地在mRNA表达分布图中，基因可在不同水平的不同细胞类型中表达，且测定是否表达水平充分地高来描述特定类型的那些细胞是极端困难的。此外，最重要的，mRNA和蛋白分布图可以是瞬变的，因为每一个受到降解酶降解，螯合在细胞内的多亚基复合物中，且每个mRNA转录本和蛋白在不同遗传背景中具有不同的半衰期。相反，本发明人已经发现甲基化标记在细胞分裂过程中是稳定遗传地。
测定DNA甲基化标记克服指定的细胞类型同一性的问题且有力地显示改编程序中产生的不适当改变。首先，DNA甲基化本身是特定细胞类型内的活性或无活性的指示剂。因此在由第一细胞类型转变为第二细胞类型时，特定选择基因组区域中的甲基化标记，(诸如基因的启动子或调节区)，将显示是否基因在处理或改编程序细胞中已被不适当地沉默。如果其已被沉默，则由此位点不能产生mRNA或蛋白产物。通过传统方法测定是否mRNA或蛋白产物存在于细胞中是非常困难的，特别是如果mRNA或蛋白的量很低时。用DNA甲基化标记则不存在这些问题，因为它们基本上是二元的特定的胞嘧啶被甲基化，或者其没有被甲基化。此外例如，如果甲基化标记是新的，且不属于第一细胞类型或第二细胞类型，然后处理的或改编程序的细胞类型被认为不适用于临床应用。
实验DNA序列选自人基因组的七个区域。通过亚硫酸氢盐修饰DNA后的DNA测序测定区域的甲基化状况。第一细胞类型表示任一改编程序处理之前的细胞类型。第二细胞类型表示第一细胞类型需要移向的目的细胞。“改编程序的”表示细胞已被用获自第二细胞类型的提取物处理的细胞和它们DNA序列的甲基化状况；标记是作为改编程序处理结果的DNA水平发生的变化的指示物。
图6表明通过分析已被改编程序的细胞的DNA甲基化标记，可产生对此改编程序的细胞已经转为期望的第二细胞类型状态的程度的测定。通过比较改编程序细胞的甲基化标记与未经处理的第一细胞类型的以及目的终点第二细胞类型的甲基化标记，可测定改编程序细胞已经按照由第一细胞类型转变为目的第二细胞类型的径迹前进的程度。因为DNA甲基化分布图在细胞分裂过程中稳定地复制，改编程序细胞将遗传以及随后精确地复制其新的改编程序标记。如果改编程序细胞的甲基化标记不同于目的终点的第二细胞类型的，然后改编程序是不完全的且改编程序细胞不能以与目的终点细胞类型相同的方式作用。因此，改编程序细胞不是用于移植目的或其它目的应用的最佳选择。只有当改编程序细胞已经符合终点第二细胞类型甲基化分布图时，改编程序细胞可被用于移植或其它的目的。
图表明通过分析已被处理或改编程序的细胞的DNA甲基化标记，可产生对此处理或改编程序的细胞已经转为期望的第二细胞类型状态的程度的测定。通过比较处理或改编程序细胞的甲基化标记与未经处理的第一细胞类型的以及目的终点第二细胞类型的甲基化标记，可测定处理或改编程序细胞已经按照由第一细胞类型转变为目的第二细胞类型的径迹前进的程度。因为DNA甲基化分布图在细胞分裂过程中稳定地复制，处理或改编程序细胞将遗传以及随后精确地复制其新的改编程序甲基化标记。如果处理的改编程序细胞的甲基化标记不同于目的终点的第二细胞类型的，然后处理或改编程序是不完全的且处理的或改编程序细胞不能以与目的终点细胞类型相同的方式作用。因此，例如处理的或改编程序细胞不是用于移植目的应用的最佳选择。只有当处理的或改编程序细胞已经符合终第二细胞类型或任一其它的目的细胞类型的甲基化标记或分布图时，改编程序细胞可被用于移植目的。
从上述结果可清楚地看出第一细胞类型的处理或改编程序后，四个测试基因(ABCB1，IRF7，ESR1 B和MAGEA2)在甲基化水平被精确地改编程序而基因CDX1显示出部分的后成改编程序。然而，THY1和GZMA两个基因没有被成功地改编程序。GZMA是T细胞-和自然杀伤细胞-特异性丝氨酸蛋白酶，因此不正确的改编程序表明这些细胞不是用于移植目的的最佳选择。
改编程序细胞中GZMA的甲基化标记是基因沉默的指示物。利用常规的基因表达分布图或蛋白组学研究来检测是极端困难的，因为基因产物不再存在。然而甲基化结果是改编程序细胞中任一潜在问题的清楚的指示物。
此方法证明了甲基化分析正确地区别改编程序的细胞类型的可能性，以及允许选择用于移植方法的最佳细胞的有效方式。这些方法对于优化与移植无关的细胞改编程序流程也是理想的。
从图6的结果可清楚地看出第一细胞类型改编程序后，四个测试区域(ABCB1，IRF7，ESR1 B和MAGEA2)在甲基化水平被精确地改编程序，而一个区域，CDX1，显示出部分的改编程序。然而，THY1和GZMA两个基因没有被成功地改编程序。GZMA是T细胞-和自然杀伤细胞-特异性丝氨酸蛋白酶，因此不正确的改编程序表明这些细胞不是用于移植目的的最佳选择。
我们的方法证明了DNA甲基化分析正确地区别改编程序的细胞类型的可能性，且提供选择用于移植方法的最佳细胞的有效方式。这些方法对于优化与移植无关的细胞改编程序流程也是理想的。
细胞类型内甲基化标记的变化。当分析相同细胞类型的细胞群体时可实现甲基化标记流程的效率，且其中转录组学和蛋白组学分析是非常难的。优选的例子是将老的造血干细胞改编程序为年轻的干细胞以及将免疫系统的老的T细胞改编程序为免疫系统的年轻细胞。在这些例子中，mRNA和蛋白水平的变化可预期是细微的且可利用常规技术展开。利用选自人基因组的位点的甲基化标记能够检测是否老化至年轻的改编程序已经成功，且最重要地，是否避免了不恰当的变化。
本领域的技术人员可以理解如特定的实施方案中所显示的可不违背本发明的精神或范围对本发明进行大量的变化和/或修饰。本发明的实施方案因此应被认为是例证性的而并非是限制性的。
权利要求
1.改变细胞特性或者状态的方法，包括如下步骤用能够改变细胞特性或者状态的试剂处理第一细胞型；以及通过测定处理的细胞基因组中的甲基化标记确定处理的细胞改变的程度，其中给定的甲基化标记显示处理细胞特性或者状态的改变。
2.根据权利要求1的方法，其中第一细胞型选自来源于患老化相关病，诸如癌症的疾病，自身免疫病，诸如心肌梗死或者局部缺血的心血管问题的个体的细胞，干细胞，免疫以及造血系统的T细胞或单核细胞，正常细胞及其混合物。
3.根据权利要求2的方法，其中第一细胞型为干细胞。
4.根据权利要求1到3任一项的方法，其中所述试剂选自化学试剂，药物，核酸，适体，抗体，抗原，插入核酸(INA)，肽核酸(PNA)，锁核酸(LNA)，己糖醇核酸(HNA)，阿卓糖醇核酸(ANA)，环己基核酸(CNA)，寡核苷酸，修饰的寡核苷酸，单链DNA，RNA，蛋白，肽，来自具有期望特性或者状态的第二细胞型的提取物，裂解物或细胞组分，其组合及其嵌合形式。
5.根据权利要求4的方法，其中所述试剂为来自具有期望特性或者状态的第二细胞型的提取物，裂解物或者细胞组分。
6.根据权利要求5的方法，其中第二细胞型为任一细胞型或者细胞型的组合。
7.根据权利要求6的方法，其中第一以及第二细胞型选自人造血系统的细胞，其它干细胞以及上皮细胞。
8.根据权利要求7的方法，其中第二细胞型源于细胞型类似于第一细胞型的正常或者健康个体。
9.根据权利要求8的方法，其中第二细胞型为干细胞。
10.根据权利要求1到9任一项的方法，其中第一细胞型细胞以及第二细胞型细胞是来自相同种类的相同细胞型。
11.根据权利要求1到9任一项的方法，其中第一细胞型细胞以及第二细胞型不是相同的细胞型。
12.根据权利要求1到9任一项的方法，其中第一种细胞型以及第二细胞型不是相同的种类。
13.根据权利要求12的方法，其中第二细胞型为两栖动物细胞并且第一细胞型为人或者其它哺乳动物细胞。
14.根据权利要求1到13任一项的方法，其中对第一细胞进行预处理以使细胞能够渗透高分子。
15.根据权利要求14的方法，其中通过电穿孔法，低温热休克或者诸如链球菌溶血素O的各种酶对细胞进行预处理。
16.根据权利要求15的方法，其中预处理可以使细胞瞬间渗透。
17.根据权利要求1到16任一项的方法，进一步包括培养或者培育处理的细胞获得多拷贝的处理细胞。
18.根据权利要求17的方法，其中处理的细胞在适合于细胞生长和分裂的条件下培养在任一适合的培养基或者宿主中。
19.根据权利要求18的方法，其中宿主为选自牛，绵羊，马，家禽和猪的家畜。
20.根据权利要求1到19任一项的方法，其中甲基化标记为基因组区域内具有对应于特异性细胞型的特征性甲基化标记的一组胞嘧啶。
21.根据权利要求1到20任一项的方法，其中通过亚硫酸氢盐修饰以及随后的DNA序列分析确定甲基化标记。
全文摘要
一种改变细胞的特性或状态，或细胞改编程序的方法，包括用能够改变细胞或特性或状态或细胞改编程序的试剂处理第一细胞类型，并通过测定处理细胞基因组内的甲基化标记测定处理细胞的改变程度，其中的甲基化标记显示处理细胞的改变的特性或状态。用于处理第一细胞的优选物质为来自第二细胞类型的细胞提取物，裂解物或组分，第二细胞类型具有目的的特性，或是第一细胞类型欲改编程序转化的目的细胞类型。实施例显示成纤维细胞的甲基化状态被改编程序为免疫系统T细胞的甲基化状态。
文档编号C12N15/01GK1717477SQ200380104473
公开日2006年1月4日 申请日期2003年11月26日 优先权日2002年11月27日
发明者道格拉斯·斯潘塞·米拉尔, 约翰·罗伯特·梅尔基, 杰弗里·W·格里格, 乔治·L·加博尔·米克洛斯 申请人:人类遗传标记控股有限公司