利用口腔上皮细胞制作单细胞测序参考品的方法
【专利摘要】本发明涉及利用口腔上皮细胞制作单细胞测序参考品的方法，包括以下步骤：a)刮取口腔上皮细胞，保存在PBS中；b)在显微镜下，用毛细口吸管吸取单个口腔上皮细胞；c)单细胞全基因组扩增，扩增后用磁珠法纯化；d)对扩增样本进行酶切，用EDTA终止实验，磁珠法纯化；e)Proton文库构建；f)Proton半导体高通量测序平台进行上机测序；g)测序数据分析。本发明提供了一种单细胞相关研究的标准品制备新途径，具有取材简单、操作方便、快捷、高分辨率的特点，适用于PGS、肿瘤早期筛查等项目。
【专利说明】利用口腔上皮细胞制作单细胞测序参考品的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及分子生物学【技术领域】，具体地说，涉及利用口腔上皮细胞制作单细胞 测序参考品的方法。
【背景技术】
[0002] 随着基因测序技术水平的提高以及千人基因组计划、癌症基因组计划、Meta-Hit 计划等重大国际合作项目的相继开展，基因组研究日渐被推向高潮。然而，迄今为止使用的 测序材料无一例外都是数百万甚至更多细胞的混合DNA样本。这种方法能够得到全基因组 序列信息，但是对其进行研究得到的结果只是一群细胞中信号的平均值，或者只代表其中 占优势数量的细胞信息，单个细胞独有的特性被忽视。另一方面，有些样品稀少无法在实验 室培养，样品量不足以进行全基因组分析，例如肿瘤循环细胞、组织微阵列、早期发育的胚 胎细胞等。这些都是全基因组测序遇到的难题。近年来，流式细胞分选和激光捕获显微切 割技术的出现以及单细胞全基因组扩增技术的不断改进，让大量单细胞的捕获和检测成为 可能。单细胞测序技术正逐渐从实验研究方法成为指导临床的有利工具，也逐渐发展出很 多的临床应用。
[0003] 目前基于单细胞水平的临床应用研究主要集中在胚胎植入前检测及肿瘤研究方 面。
[0004] 利用高通量测序技术对胚胎进行植入前遗传学筛查（Preimplantation Genetic Screening，PGS)，是通过分离少量的胚胎细胞进行单细胞测序，从而检测体外培养的胚胎 染色体数目和结构异常，挑选正常的胚胎植入子宫，对获得正常的妊娠，提高临床妊娠率和 活产率，降低多胎妊娠具有重要意义。而在技术研发过程中以及数据分析过程中，需要有相 应的正常单细胞对照样本进行对比分析。
[0005] 肿瘤研究方面，肿瘤的异质性是目前研究较多的方向之一，肿瘤在生长过程中，由 于其分裂增殖的无限性，突变率增加，其子细胞呈现出分子生物学或基因方面的改变，从而 使肿瘤的生长速度、侵袭能力、对药物的敏感性、预后等各方面产生差异。简单点说就是同 一肿瘤中可以存在有很多不同的基因型或者亚型的肿瘤细胞。因此同一种肿瘤在不同的个 体身上可表现出不一样的治疗效果及预后，甚至同一个体身上的肿瘤细胞也存在不同的特 性和差异。因此在单细胞水平上研究肿瘤细胞，对于肿瘤的检测和研究甚至个体化医疗方 面具有重要意义。而肿瘤单个细胞的研究同样需要有正常的体细胞进行对照分析。
[0006] 此外，基于临床应用的试剂盒在开发过程中需要有对照样本进行试剂盒的性能评 价。在后续的试剂盒注册审批过程中也需要有相应的标准品进行注册检验。因此进行单细 胞研究首先要建立单细胞对照样本，但是由于临床样本的稀有和一系列社会学伦理学因素 的制约，很难收集和处理临床样本。因此临床上迫切需要一种可以用于单细胞研究的简单 有效的单细胞实验材料和处理方法。临床上常用的血液样本在分离有核细胞时，通常会受 到红细胞等干扰，很难确保分离细胞的准确性。
[0007] 综上所述，亟需一种简便准确的制作单细胞测序参考品的方法。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种。
[0009] 利用口腔上皮细胞制作单细胞测序参考品的方法，包括以下步骤：
[0010] a) 口腔上皮细胞获得、保存：刮取口腔上皮细胞，保存在PBS溶液中；
[0011] b)分离单个口腔上皮细胞：在显微镜下，用毛细口吸管吸取单个口腔上皮细胞；
[0012] c)单细胞全基因组扩增：对单细胞样本进行全基因组扩增，扩增后的样本用磁珠 法纯化DNA ;
[0013] d) DNA片段化：对扩增样本进行酶切，用EDTA终止实验，然后用磁珠法纯化酶切产 物；
[0014] e) Proton文库构建：用DNA酶切后的产物进行文库构建，DNA片段末端补平后纯 化，两端加特异性接头后纯化，PCR扩增后纯化；
[0015] f)Proton半导体高通量测序平台进行上机测序：计算文库的稀释倍数，利用乳液 PCR技术形成达到测序要求的阳性测序模板，利用半导体测序系统对测序模板进行测序，最 终获得每个DNA片段的喊基序列；
[0016] g)测序数据分析：将测序结果利用生物信息学分析把这些序列定位到人类基因 组参考图谱上，通过与参考基因组的对比分析样本的信息。
[0017] 步骤a)中，刮取口腔上皮细胞前先用凉开水漱口，保证刮取的细胞中不含有除口 腔上皮细胞以外的其他成分。
[0018] 步骤a)中，刮取口腔上皮细胞时，用干净的牙签平贴口腔两侧颊部，轻轻刮取口 腔上皮细胞，避免损伤口腔内壁。
[0019] 步骤b)中，在吸取单个口腔上皮细胞之前，根据PBS溶液中细胞的密度在培养皿 上进行梯度稀释，从最后稀释的液体中吸取单个口腔上皮细胞。
[0020] 步骤b)中，用毛细口吸管吸取单个口腔上皮细胞时，先让毛细管插入干净的PBS 溶液中使其自然虹吸结束后拿出再进行单个口腔上皮细胞的吸取。
[0021] 步骤e)中，所述的纯化是采用磁珠法纯化。
[0022] 本发明优点在于：
[0023] 本发明提供了一种单细胞相关研究的标准品制备新途径，能够精确地对单个口腔 上皮细胞的基因组DNA进行测序分析，过程中无细胞外游离DNA及外源DNA污染，配合半导 体高通量测序技术平台，即能标准化、流程化、方便快捷的建立单细胞相关研究标准品。口 腔上皮细胞相对人体的绝大多数细胞具有表面积大、容易分辨的特点，用单个或微量口腔 上皮细胞进行整个全基因组范围的研究，取材上更经济方便，避免了其它活体取材方式的 创伤性，用单个口腔上皮细胞建立单细胞研究和检测标准品，对于临床试管婴儿胚胎植入 前遗传学筛查、肿瘤研究和治疗、单细胞的组学研究等具有重大意义。
【专利附图】
【附图说明】
[0024] 图1人口腔上皮细胞染色图。
[0025] 图2单细胞扩增结果电泳图。
[0026] 图3单细胞基因组文库构建片段分析图。
[0027] 图4人口腔上皮细胞单细胞测序数据分析。
【具体实施方式】
[0028] 下面结合附图对本发明提供的【具体实施方式】作详细说明。
[0029] 对24例健康人员口腔上皮细胞分别分得单细胞，从每个人的口腔上皮细胞中取 得8个单细胞样本，其中包括一个阴性对照。通过电泳分析和测序结果比对分析等方法，以 证实对人口腔上皮细胞的单细胞进行扩增和测序来建立人单细胞相关实验研究标准品的 可行性。
[0030] L人口腔上皮细胞获得、保存
[0031] 细胞捐献者先用凉开水漱口，去除口腔中的食物残渣，保证刮取的细胞中不含有 除人口腔上皮细胞以外的其他成分。用干净的牙签平贴口腔两侧颊部，轻轻刮取口腔上皮 细胞，避免损伤口腔内壁，然后将粘有口腔上皮细胞的牙签的一端在IXPBS溶液中反复蘸 几下，使细胞分散到PBS溶液中，透过光线可以看到散布在PBS溶液中的微小的白色固形物 即为人的口腔上皮细胞。取完细胞后，可以立即用于后续试验，也可以在4摄氏度冰箱中短 时间放置。
[0032] 2.分离单个人口腔上皮细胞
[0033] 为了进一步保证口腔上皮细胞的清洁无污染状态，可以对装有样本的PCR管进行 低速离心，去掉上清液，再向其中加入100 μ L I XPBS溶液，吹打混匀使细胞重悬。
[0034] (1)在吸取人的单个口腔上皮细胞之前，首先要根据溶液中细胞的密度在培养皿 上进行梯度稀释，一般进行三次梯度稀释。一般稀释方法为：用移液枪吸取干净的PBS溶 液，间隔的滴4滴在培养皿表面上（每滴大约90 μ L)，液滴之间保持一定的距离，避免相互 间的干扰；吹打混匀含有样品的PBS溶液，使口腔上皮细胞均匀分散，从中吸取液体滴一滴 (约为10 μ L)到第一滴干净的PBS溶液中，吹打混匀；从第一滴液体中吸取一滴液体（约 为10 μ L)到第二滴干净的PBS中，吹打均匀；如上步再从第二滴液体中吸取一滴液体到第 三滴干净的PBS溶液中。通过对最后一次稀释的液滴的不同高度对焦观察，确定液滴中细 胞个体间均匀分散，细胞总数在20个以内，细胞分布状况如图1所示（图中细胞染色只是 为了示意细胞分布，实际实验中并不需要染色即可观察到几近透明的扁平不规则的口腔上 皮细胞），从最后的液体中吸取单细胞。
[0035] (2)由于液体的表面张力和压强，很容易造成液体虹吸进入毛细玻璃管中，使实 验操作难以控制，因此吸取单细胞之前，先将毛细管插入剩下的一滴干净的IXPBS溶液中 使其自动虹吸，当毛细管内液面不再上升后拿出。在体视显微镜下，用毛细口吸管吸取单 个口腔上皮细胞。吸取单细胞之前要先吸取一部分细胞间的PBS液体作为阴性对照，放入 200 μ L PCR管中，然后再分别吸取单细胞到标记好的200 μ L PCR管中，含有单细胞的样品 管内的液体应在1 μ L以内。每次吸取细胞前都要让毛细管插入干净的PBS溶液中使其自 然虹吸结束后拿出，然后才能吸取下一个单细胞。
[0036] 3.单细胞全基因组扩增
[0037] 采用单细胞全基因组扩增试剂盒（江苏亿康基因科技有限公司）对单细胞样本进 行非指数性扩增，避免扩增偏好性。
[0038] (1)细胞裂解
[0041]
[0039] 根据样本数量N按下表配制细胞裂解混合液：[0040]
【权利要求】
1. 利用口腔上皮细胞制作单细胞测序参考品的方法，其特征在于，包括以下步骤： a) 口腔上皮细胞获得、保存：刮取口腔上皮细胞，保存在PBS溶液中； b) 分离单个口腔上皮细胞：在显微镜下，用毛细口吸管吸取单个口腔上皮细胞； c) 单细胞全基因组扩增：对单细胞样本进行全基因组扩增，扩增后的样本用磁珠法纯 化 DNA ; d) DNA片段化：对扩增样本进行酶切，用EDTA终止实验，然后用磁珠法纯化酶切产物； e) Proton文库构建：用DNA酶切后的产物进行文库构建，DNA片段末端补平后纯化，两 端加特异性接头后纯化，PCR扩增后纯化； f) Proton半导体高通量测序平台进行上机测序：计算文库的稀释倍数，利用乳液PCR 技术形成达到测序要求的阳性测序模板，利用半导体测序系统对测序模板进行测序，最终 获得每个DNA片段的喊基序列； g) 测序数据分析：将测序结果利用生物信息学分析把这些序列定位到人类基因组参 考图谱上，通过与参考基因组的对比分析样本的信息。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤a)中，刮取口腔上皮细胞前先用凉开 水漱口，保证刮取的细胞中不含有除口腔上皮细胞以外的其他成分。
3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤a)中，刮取口腔上皮细胞时，用干净 的牙签平贴口腔两侧颊部，轻轻刮取口腔上皮细胞，避免损伤口腔内壁。
4. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤b)中，在吸取单个口腔上皮细胞之 前，根据PBS溶液中细胞的密度在培养皿上进行梯度稀释，从最后稀释的液体中吸取单个 口腔上皮细胞。
5. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤b)中，用毛细口吸管吸取单个口腔上 皮细胞时，先让毛细管插入干净的PBS溶液中使其自然虹吸结束后拿出再进行单个口腔上 皮细胞的吸取。
6. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤e)中，所述的纯化是采用磁珠法纯 化。
【文档编号】C12Q1/68GK104404034SQ201410769398
【公开日】2015年3月11日 申请日期:2014年12月15日 优先权日:2014年12月15日
【发明者】梁波, 孔令印, 申静静, 刘慧敏, 孙丹凤 申请人:赛业健康研究中心（太仓）有限公司