专利名称：基因组被修饰的细胞的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种基因组被修饰的细胞，与其亲代细胞相比，具有降低的或去除了和糖链修饰相关的酶的活性，所述糖链中岩藻糖的I-位与N-糖苷连接糖链复合体还原末端的N-乙酰氨基葡萄糖的6-位通过α -键结合，以及采用该细胞产生抗体分子的过程。
背景技术：
在IgG类抗体的Fe区，存在两个N-糖苷连接糖链结合位点。在血清IgG中，通常在糖链结合位点上结合了一个具有多个分支的复合物型糖链，其中加入的唾液酸或等 分N-乙酰氨基葡萄糖很少。已知就半乳糖加入至复合物型糖链非还原末端上和岩藻糖 添加至还原末端的N-乙酰氨基葡萄糖上有一定的多样性[Biochemistry (生物化学),36, 130(1997)]。这种糖链结构已认为可通过糖链基因来确定，也就是合成糖链的糖基转移酶的基因和水解糖链的糖酵解酶的基因。N-糖苷连接糖链的合成如下所述。糖蛋白在内质网(以后称为“ER”)腔中用糖链进行修饰。在N-糖苷连接糖链的生物合成步骤中，相对大的糖链被转移至在ER腔中延伸的多肽链上。在转变过程中，糖链首先连续加入到由大约20个α-异戊二烯单位组成的长链脂质载体的磷酸基团上，称为磷酸多萜醇(此后有时称为"P-Dol")。即，N-乙酰氨基葡萄糖被转移至磷酸多萜醇形成GIcNAc-P-P-DoI，然后转移又一个GlcNAc，从而形成 GlcNAc-GlcNAc-P-P-DoI。下一步，5 个甘露糖(此后有时甘露糖被称为"Man")被转移，因此形成(Man)5-(GlcNAc)2-P-P-Dol,然后四个Man和三个葡萄糖(此后葡萄糖有时被称为"Glc")被转移。因此，形成了糖链前体，(Glc)3-(Man)9-(GlcNAc)2-P-P-D0I,称为形成了核心寡糖。含有14个糖的糖链前体被作为一个团体转移至内质网腔中含有天冬酰胺-X-丝氨酸或天冬酰胺-X-苏氨酸序列的多肽上。在反应中，结合至核心寡糖上的磷酸多萜醇(P-P-Dol)被释放，但通过焦磷酸酶的水解作用再次成为磷酸多萜醇，并再进行循环。在糖链与多肽结合后立即开始糖链的加工。即，三个Glc和一个或两个Man在内质网上被删除，已知α -I, 2_葡萄糖苷酶I，α -1，3_葡萄糖苷酶II和α-1,2-甘露糖苷酶与删除作用有关。在内质网上被加工的糖蛋白被转移至闻尔基体上，被进行不同的修饰。在闻尔基体的池(cis)部分,存在有关添加甘露糖憐酸的N-乙酰氨基葡萄糖磷酸转移酶，N-乙酰氨基葡萄糖I-磷酸二酯α -N-乙酰氨基葡萄糖苷酶和α -甘露糖苷酶I，并将Man残基还原至5。在高尔基体的中间部分，存在涉及在复合物型N-糖苷连接糖链的外侧第一个GIcNAc的添加的N-乙酰氨基葡萄糖转移酶I (GnTI)，涉及删除两个Man的α -甘露糖苷酶II，涉及从外侧添加第二个GIcNAc的N-乙酰氨基葡萄糖转移酶II (GnTII)和涉及岩藻糖添加至还原末端的N-乙酰氨基葡萄糖上的α 1，6_岩藻糖基转移酶。在高尔基体的trans部分,存在与半乳糖的添加有关的半乳糖转移酶和与唾液酸如N-乙酰神经氨酸的添加有关的唾液酸转移酶或类似物。已知N-糖苷连接糖链是通过这些不同酶的作用形成的。就抗体中的糖链而言，据报道岩藻糖向抗体N-糖苷连接糖链还原末端N-乙酰氨基葡萄糖的添加修饰极大地改变了抗体的抗体依赖的细胞介导细胞毒活性(此后称为“ADCC活性”)(W000/61739)。这个报道表明糖链的结构在人抗体IgGl亚型的效应器功能中发挥重要作用。通常，考虑用作药物的大多数人源化抗体通过使用遗传重组技术制备，使用动物细胞，如中国仓鼠卵巢组织来源的CHO细胞作为宿主细胞产生。但如上所述，由于糖链结构在抗体的效应器功能中发挥非常重要的作用，并在宿主细胞表达的糖蛋白的糖链结构中观察到一些差异，需要开发用于产生具有更高效应器功能的抗体的宿主细胞。也已经进行了修饰通过导入有关糖链修饰的酶基因产生的糖蛋白的糖链结构的尝试，作为其例子，已有报道I)可能产生一种蛋白，其中大量唾液酸通过将大鼠β-半乳·糖苷-α -2，6-唾液酸转移酶导入CHO细胞中而被添加至糖链的非还原末端上[J. Biol.Chem.(生物化学杂志)，261. 13848 (1989) ]，2)通过将人β -半乳糖苷_2_ α -岩藻糖基转移酶转移至小鼠L细胞中，可能表达一种H抗原，其中岩藻糖(此后称为“Fuc”)被添加至糖链的非还原末端上(Fuc a l-2Gal β I-) [Science (科学)，252. 1668 (1991)]，和 3)通过使用一种导入了 β_1，4-Ν-乙酰氨基葡萄糖转移酶III(GnTIII)的CHO细胞产生一种抗体，从而可能产生一种N-糖苷连接糖链的等分N-乙酰氨基葡萄糖添加比例很高的抗体[Glycobiology(糖生物学)，泛，813(1995) :W0 99/54342]。当通过使用导入了 GnTIII 的CHO细胞表达抗体时，所述抗体显示较亲代细胞中表达的抗体高16倍的ADCC活性。然而，由于已有报道GnTIII或β-1，4-Ν-乙酰氨基葡萄糖转移酶V (GnTV)的过度表达显示出对CHO细胞的毒性，因此其不适合产生抗体药物。对糖蛋白的生产例子也已有报道，其中产生的糖链结构可通过使用一种突变体作为宿主细胞而改变，该突变体中有关糖链修饰的酶基因的活性被改变，作为其例子，已有报道使用CHO细胞的一种突变体克隆产生了具有高甘露糖型(high mannose type)糖链结构的抗体，该突变体克隆中4-N-乙酰氨基葡萄糖转移酶I (GnTI)被删除[J. Immunol.(免疫学杂志)，160，3393 (1998)]。另外，已经报道了一种抗体表达,其具有一种糖链结构,其中唾液酸未被添加至糖链非的还原末端侧，和通过使用CMP-唾液酸转运子或UDP-半乳糖转运子缺陷克隆产生的未添加半乳糖的抗体表达例子，但没有发现具有增强的效应器功能，适合用作药物的抗体[J. Immunol.(免疫学杂志),160，3393 (1998)]。由于已经获得的突变体克隆是通过诱变剂处理导入随机突变得到的克隆，它们不适合作为用于产生药学制剂的克隆。因此，为了修饰制备的糖蛋白的糖链结构，已经进行了许多在宿主细胞中控制有关糖链修饰的酶活性的尝试。但实际上，由于糖链修饰机制是多样化和复杂的，不能说糖链的生理作用已被完全阐明，因此目前的情况是要反复试验和错误。特别的是已经逐渐地阐明了抗体的效应器功能受糖链结构的影响很大，但能够产生具有最合适的糖链结构修饰的抗体分子的宿主细胞目前还没有获得。
发明内容
本发明涉及下列的⑴至(43)。(I) 一种修饰基因组以使与糖链修饰相关的酶的活性比其亲代细胞更低或消失的细胞，所述糖链中岩藻糖的I位与N-糖苷连接的糖链复合体中还原端的N-乙酰氨基葡萄糖的6位通过α -键连接。(2)根据(I)的细胞，其中编码糖链修饰相关酶的基因组基因被敲除，所述糖链中岩藻糖的I位与N-糖苷连接的糖链复合体中还原端的N-乙酰氨基葡萄糖的6位通过α-键连接。(3)根据(I)或(2)的细胞，编码糖链修饰相关酶的基因组上的所有等位基因被敲除，所述糖链修饰中岩藻糖的I位与N-糖苷连接的糖链复合体中还原端的N-乙酰氨基葡萄糖的6位通过α -键连接。
(4)根据(I)至(3)任一项中的细胞，与糖链修饰相关的酶是α 1，6_岩藻糖基转移酶，所述糖链中岩藻糖的I位与N-糖苷连接的糖链复合体中还原端的N-乙酰氨基葡萄糖的6位通过α -键连接。(5)根据(4)的细胞，α 1，6-岩藻糖基转移酶是选自以下(a)至⑷的DNA编码的蛋白质(a)含有SEQ ID NO: I所示的核苷酸序列的DNA;(b)含有SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列的DNA;(C)在严格条件下，与包含SEQ ID NO: I所示的核苷酸序列的DNA杂交，并具有α 1，6-岩藻糖基转移酶活性的DNA;(d)在严格条件下，与包含SEQ ID N0:2所示的核苷酸序列的DNA杂交，并具有α 1，6-岩藻糖基转移酶活性的DNA。(6)根据(4)的细胞，α 1，6-岩藻糖基转移酶是选自以下(a)、(b)、(c)、(d)、(e)和(f)的蛋白质(a)含有SEQ ID N0:4所示氨基酸序列的蛋白质；(b)含有SEQ ID NO:5所示氨基酸序列的蛋白质；(c)含有SEQ ID N0:4所示氨基酸序列中至少一个氨基酸被删除、取代、插入、和/或添加的氨基酸序列，并具有α 1，6-岩藻糖基转移酶活性的蛋白质；(d)含有SEQ ID NO: 5所示氨基酸序列中至少一个氨基酸被删除、取代、插入、和/或添加的氨基酸序列，并具有α 1，6-岩藻糖基转移酶活性的蛋白质；(e)含有与SEQ ID N0:4所示氨基酸序列具有80%或以上同源性的氨基酸序列，并具有α 1，6-岩藻糖基转移酶活性的蛋白质；(f)含有与SEQ ID N0:5所示氨基酸序列具有80%或以上同源性的氨基酸序列，并具有α 1，6-岩藻糖基转移酶活性的蛋白质。(7)根据(I)至(6)任一项中的细胞，此细胞对识别糖链的凝集素具有抗性，所述糖链中岩藻糖的I位与N-糖苷连接的糖链复合体中还原端的N-乙酰氨基葡萄糖的6位通过α-键连接。(8)根据(7)的细胞，此细胞对选自以下(a)至⑷的至少一个凝集素具有抗性(a)小扁豆凝集素；
(b)豌豆凝集素；(c)蚕豆凝集素；(d)陈皮木耳凝集素。(9)根据⑴至⑶任一项中的细胞，此细胞选自以下(a)至(j):(a)来源于中国仓鼠卵巢组织的CHO细胞；(b)大鼠骨髓瘤细胞系 YB2/3HL. P2. Gil. 16Ag. 20 细胞；(c)小鼠骨髓瘤细胞系NSO细胞；(d)小鼠骨髓瘤细胞系SP2/0_Agl4细胞；·(e)来源于叙利亚仓鼠肾组织的BHK细胞；(f)产生抗体的杂交瘤细胞；(g)人白血病细胞系Namalwa细胞；(h)胚胎干细胞；⑴受精卵细胞；(j)植物细胞。(10)根据⑴至(9)任一项中的细胞，此细胞含有编码抗体分子的基因。(11)根据(10)的细胞，此的抗体分子选自以下的(a)至⑷:(a)人抗体；(b)人源化抗体；(c)含(a)或(b)Fc区的抗体片段；(d)含(a)或(b)Fc区的融合蛋白质。(12)根据(10)或(11)的细胞，其中抗体分子属于IgG型。(13)根据(I)至(12)任一项中的细胞，此细胞产生的抗体组合物比其亲代细胞产生的抗体组合物具有更高的抗体依赖性细胞介导细胞毒活性。(14)根据(13)的细胞，其中具有更高抗体依赖性细胞介导细胞毒活性的抗体组合物比其亲代细胞产生的抗体组合物具有更高的糖链比例，所述糖链中岩藻糖不与Fe区结合的N-糖苷连接的糖链总复合体中还原端的N-乙酰氨基葡萄糖连接。(15)根据(14)的细胞，其中不连接岩藻糖的糖链中，岩藻糖的I位不与N-糖苷连接的糖链复合体中还原端的N-乙酰氨基葡萄糖的6位通过α -键连接。(16)根据(13)至(15)任一项中的细胞，其中岩藻糖不与还原端的N-乙酰氨基葡萄糖通过α -键连接的糖链比例是抗体组合物中与Fe区结合的N-糖苷连接糖链总复合体的20%或以上。(17)根据(13)至(16)任一项中的细胞，其中具有更高抗体依赖性细胞介导细胞毒活性的抗体组合物没有岩藻糖与糖链还原端的N-乙酰氨基葡萄糖结合的糖链。(18) 一种产生抗体组合物的方法，其中所述的方法包括使用根据求10至17任一项中所述的细胞。(19) 一种产生抗体组合物的方法，所述方法包括在培养基中培养根据(10)至
(18)任一项中所述的细胞，在培养基中形成和积累抗体组合物；并从培养基中回收抗体组合物。(20)根据(18)或(19)所述的方法，所述抗体组合物是比其亲代细胞产生的抗体组合物具有更高抗体依赖性细胞介导细胞毒活性的抗体组合物。(21)根据(20)的步骤，所述的具有更高抗体依赖性细胞介导细胞毒活性的抗体组合物比其亲代细胞产生的抗体组合物具有更高的糖链比例，所述糖链中岩藻糖不与Fe区结合的N-糖苷连接的糖链总复合体中还原端的N-乙酰氨基葡萄糖连接。糖不与N-乙酰氨基葡萄糖在还原端结合。(22)根据(21)的步骤，所述的不连接岩藻糖的糖链中，岩藻糖的I位不与N-糖苷连接的糖链 总复合体中还原端的N-乙酰氨基葡萄糖的6位通过α -键连接。(23)根据(20)至(22)任一项中的细胞，所述的具有更高抗体依赖性细胞介导细胞毒活性的抗体组合物是与抗体组合物Fe区结合的N-糖苷连接的糖链总复合体中，岩藻糖不与还原端的N-乙酰氨基葡萄糖通过α -键连接的糖链比例是抗体组合物中与Fe区结合的N-糖苷连接糖链总复合体的20%或以上。(24)根据(20)至(23)任一项中的细胞，所述的具有更高抗体依赖性细胞介导细胞毒活性的抗体组合物是没有岩藻糖与糖链中还原端N-乙酰氨基葡萄糖连接的抗体组合物。(25)使用根据(I)至(9)任一项中细胞产生的转基因非人动物或植物或其后代。(26)根据(24)的转基因非人动物或植物或其后代，所述的转基因非人动物选自牛、绵羊、山羊、猪、马、小鼠、大鼠、家禽、猴和兔。(27)根据(25)或(26)所述的转基因非人动物或植物或其后代，其被导入了编码抗体分子的基因。(28)根据(27)的转基因非人动物或植物或其后代，所述的抗体分子选自以下(a)至(d):(a)人抗体；(b)人源化抗体；(c)含(a)或(b)Fc区的抗体片段；(d)含(a)或(b)Fc区的融合蛋白质。(29)根据(27)或(28)的转基因非人动物或植物或其后代，所述的抗体分子属于IgG 族。(30) 一种产生抗体组合物的步骤，其特征在于包括培养根据(27)至(29)任一项中的转基因非人动物或植物；分离从培养的动物或植物中诱导的含有抗体分子的组织或体液；从分离的组织或体液中回收含所需抗体分子的抗体组合物。(31) 一种产生抗体组合物的步骤，其特征在于包括从根据(26)至(29)任一项中的转基因非人动物或植物或其后代中分离产生抗体的细胞；在培养基中培养分离的产生抗体的细胞，在培养基中形成和积累抗体组合物；从培养基中回收抗体组合物。(32)根据(30)或(31)的步骤，所述的抗体组合物是比基因组未被修饰的转基因非人动物或植物或其后代产生的抗体组合物具有更高抗体依赖性细胞介导细胞毒活性的抗体组合物。(33)根据(32)的步骤，所述的具有更高抗体依赖性细胞介导细胞毒活性的抗体组合物比基因组未被修饰的转基因非人动物或植物或其后代产生的抗体组合物具有较高比例的糖链，所述糖链中岩藻糖不与和抗体组合物Fe区结合的N-糖苷连接的糖链总复合体的还原端的N-乙酰氨基葡萄糖连接。(34)根据(33)的步骤，糖链中岩藻糖的I位不与N-糖苷连接的糖链总复合体的还原端位置的N-乙酰氨基葡萄糖的6位通过α -键连接。(35)根据(32)至(34)任一项中的步骤，具有更高抗体依赖性细胞介导细胞毒活性的抗体组合物中岩藻糖不与还原端的N-乙酰氨基葡萄糖通过α -键连接的糖链比例是抗体组合物中与Fe区结合的N-糖苷连接糖链总复合体的20%或以上。(36)根据(32)至(35)任一项中的细胞，具有更高抗体依赖性细胞介导细胞毒活 性的抗体组合物是糖链中没有岩藻糖与还原端的N-乙酰氨基葡萄糖连接的抗体组合物。(37) 一种含有Fe区具有N-糖苷连接糖链的抗体分子的抗体组合物，具有岩藻糖不与和抗体组合物Fe区结合的N-糖苷连接的糖链总复合体的还原端的N-乙酰氨基葡萄糖连接的糖链。(38)根据37所述的抗体组合物，不连接岩藻糖的糖链是岩藻糖的I位不与N-糖苷连接的糖链复合体的还原端的N-乙酰氨基葡萄糖的6位通过α -键连接的糖链。(39) 一种通过(18)至(24)任一项中的步骤产生的抗体组合物。(40) 一种通过(27)至(36)任一项中的步骤产生的抗体组合物。(41)含有根据(37)至(40)任一项中的抗体组合物作为活性成分的药物。(42)根据(41)的药物，其是以下疾病的诊断剂、预防剂或治疗剂肿瘤相关疾病、变态反应相关疾病、炎症相关疾病、自身免疫性疾病、心血管疾病、病毒感染相关疾病或细菌感染相关疾病。(43)在生产根据(41)或(42)的药物中对根据(37)至(40)任一项的抗体组合物的应用。在修饰基因组以便较其亲代细胞具有较低的或去除了有关糖链修饰酶的活性的细胞(此后称为“本发明的细胞”)中修饰基因组的方法并不特别限制，只要细胞基因组的修饰是为了较其亲代细胞具有较低的或去除了有关糖链修饰酶(此后称为"al，6-岩藻糖修饰酶")的活性，其特征在于所述糖链中岩藻糖的I-位与N-糖苷连接糖链复合体还原末端的N-乙酰氨基葡萄糖的6-位通过α -键结合。亲代细胞是降低或去除α I, 6-岩藻糖修饰酶活性的方法应用于基因组之前的细胞。亲代细胞不特别限制，包括下列细胞。NSO亲代细胞包括下列文献中所描述的NSO细胞如BIO/TECHNOLOGY, 10, 169 (1992)和 Biotechnol. Bioeng. ,73, 261 (2001)，在 RIKEN 细胞银行，物理化学研究协会中登记的NSO细胞系(RCB 0213)，通过将这些细胞系移植至它们可生长的培养基中获得的亚细胞系，和类似细胞。SP2/0-Agl4亲代细胞包括在下面文献中所描述的SP2/0_Agl4细胞，如J. Immunol.(免疫学杂志),126, 317 (1981), Nature (自然),276. 269(1978)和 HumanAntibodies and Hybridomas, 3, 129(1992)，在 ATCC 中登记的 SP2/0_Agl4 细胞(ATCCCRL-1581)，通过将这些细胞系移植至它们生长的培养基中获得的亚细胞系(ATCCCRL-1581. I)，和类似细胞。来自中国仓鼠卵巢组织的CHO亲代细胞包括在下列文献中所描述的 CHO 细胞，如 Journal of Experimental Medicine (实验医学杂志)(Jikken Igaku), 108.945(1958), Proc. Natl. Acad. Sci.(美国科学院学报)USA, 60, 1275(1968), Genetics (遗传学)，迪，513(1968)，Chromosoma(染色#),41., 129 (1973), Methods in Cell Science (细胞学方法)，丛，115 (1996)，RadiationResearch (放射研究).148. 260(1997). Proc. Natl.Acad.Sci.(美国科学院学报)USA, II，4216 (1980) ,Proc. Natl. Acad. Sci.(美国科学院学报)USA, Μ, 1275(1968), Cell ( M ),6,121 (1975)和 Molecular Cell Genetics(遗传学)，Appendix I，H (883-900 页)，在 ATCC 登记的细胞系 CH0-K1 (ATCC CCL-61)、细胞系 DUXBll (ATCC CRL-9096)和细胞系 Pro_5 (ATCC CRL-1781)，市售的细胞系 CH0-S (LifeTechnologies的Cat #11619)，通过将这些细胞系移植至它们生长的培养基中获得的亚细胞系，和类似细胞。大鼠骨髓瘤细胞系YB2/3HL. P2. Gil. 16Ag. 20亲代细胞包括从Y3/Agl. 2. 3细胞(ATCC CRL-1631)建立的细胞系，在下面文献中描述的YB 2/3HL. P2. Gil. 16Ag. 20细胞如J. Cell. Biol.，93, 576 (1982)和 Methods EnzymoI.(酶学方法)，73B, I (1981)，在 ATCC 登记的YB2/3HL. P2. Gil. 16Ag. 20细胞(ATCC CRL-1662)，通过将这些细胞系移植至它们生长的培养基中获得的亚细胞系，和类似细胞。岩藻糖的I位通过α -键和复合体N-糖苷连接糖链的还原末端N-乙酰氨基葡萄糖的6位结合的反应。涉及在复合体N-糖苷连接糖链的还原末端通过α -键岩藻糖的I位和N-乙酰氨基葡萄糖的6位结合的反应的酶包括对在复合体N-糖苷连接糖链的还原末端通过α -键岩藻糖的I位和N-乙酰氨基葡萄糖的6位结合的反应有影响的酶。I, 6-岩藻糖修饰酶包括α 1，6_岩藻糖基转移酶，a _L_岩藻糖苷酶和类似酶。对在复合体N-糖苷连接糖链的还原末端通过α -键岩藻糖的I位和N-乙酰氨基葡萄糖的6位结合的反应有影响的酶也包括对涉及在复合体N-糖苷连接糖链的还原末端通过α-键岩藻糖的I位和N-乙酰氨基葡萄糖的6位结合反应的酶活性有影响的酶，和对物质的结构如酶的底物一样有影响的酶。在本发明中，α 1,6-岩藻糖修饰酶包括下列(a), (b)，(c)或(d)的DNA编码的蛋白和下列(e), (f), (g), (h),⑴或(j)的蛋白质(a)含有SEQ ID NO: I代表的核苷酸序列的DNA ；(b)含有SEQ ID NO:2代表的核苷酸序列的DNA ；(c)与含有SEQ ID NO: I代表的核苷酸序列的DNA在严格条件下杂交并编码具有α 1,6-岩藻糖转移酶活性的蛋白质的DNA ；(d)与含有SEQ ID NO: 2代表的核苷酸序列的DNA在严格条件下杂交并编码具有α 1,6-岩藻糖转移酶活性的蛋白质的DNA ；(e)含有SEQ ID NO:4代表的氨基酸序列的蛋白质；(f)含有SEQ ID NO:5代表的氨基酸序列的蛋白质；(g)含有下列的氨基酸序列的蛋白质，其中在由SEQ ID N0:4所代表的氨基酸序列其中至少一个氨基酸被删除、取代、插入和/或添加，并具有α I, 6-岩藻糖转移酶活性；(h)含有下列的氨基酸序列的蛋白质，其中在由SEQ ID N0:5所代表的氨基酸序列，其中至少一个氨基酸被删除、取代、插入和/或添加，并具有α 1，6-岩藻糖转移酶活性；
(i)含有与SEQ ID NO:4所代表的氨基酸序列具有80%或更多同源性的氨基酸序列，并具有α 1，6-岩藻糖转移酶活性的蛋白质；(j)含有与SEQ ID NO: 5所代表的氨基酸序列具有80%或更多同源性的氨基酸序列，并具有α 1，6-岩藻糖转移酶活性的蛋白质，和类似物。在本发明中，在严格条件下杂交的DNA是例如通过如克隆杂交(colonyhybridization),卩遼菌斑杂交或Southern印迹杂交的方法,使用如具有SEQ ID NO: I或2代表的核苷酸序列的DNA或其部分片段作为探针获得的DNA，并特别包括可在O. 7至I. OM氯化钠存在下，采用滤膜在65°C进行杂交所鉴定的DNA，其中群体或噬菌斑来源的DNA片段固定在滤膜上，然后在65°C使用O. I至2XSSC溶液(由150mM的氯化钠和15mM的柠檬酸钠组成的I X SSC溶液的组合物)冲洗滤膜。可以根据已描述的方法进行杂交，如在MolecularCloning, A Labooratory Manual (分子克隆，实验手册)，第二版，Cold Spring HarborLaboratory Press (冷泉港实验室印刷)(1989)(此后称为“分子克隆，第二版”)，现代分子生物学方法，John Wiley & Sons, 1987-1997 (此后称为“现代分子生物学方法”)，DNA克隆核心技术，实践方法，第二版，牛津大学(1995);和类似文章。可杂交的DNA包括与SEQID·NO: I或2所示核苷酸序列具有至少60%或更多，优选70%或更多，更优选80%或更多，进一步优选90%或更多，更为优选的是95%或更多，最优选98%或更多。在本发明中，含有SEQ ID N0:4或5所代表的氨基酸序列，其中至少一个氨基酸被删除，取代，插入和/或添加，并具有α 1，6-岩藻糖转移酶活性的蛋白质，可通过例如将一个位点定向突变导入分别具有SEQ ID Ν0:4或5所示氨基酸序列的蛋白质的编码DNA中，使用如下所述的位点定向突变，如在分子克隆，第二版；现代分子生物学方法，NucleicAcids Research (核酸研究),10, 6487 (1982) ；Proc. Natl. Acad. Sci.(美国科学院学M ) USA, 79, 6409(1982) ; Gene(基因),Μ, 315(1985) ; Nucleic Acids Research (核酸研^), 13, 4431(1985) ; Proc. Natl. Acad. Sci.(美国科学院学报)USA,盤，488 (1985);和类似文章。被删除，取代，插入和/或添加的氨基酸数量是一个或多个，这个数量不特别限制，但这个数量是可以通过一种已知的技术，如位点定向突变删除，取代或添加，例如I至几十，优选I至20，更优选I至10，最优选I至5。在本发明中，含有与SEQ ID NO:4或5所示氨基酸序列具有80%或更多同源性的氨基酸序列，并具有α 1，6-岩藻糖基转移酶活性的蛋白质，当采用分析软件如BLAST [J. Mol.Biol. .215. 403 (1990) I. FAST A「酶学方法，183, 63 (1990) I 或类似方法计算时，与 SEQ IDΝ0:4或5所示氨基酸序列具有至少80%或更多，优选85%或更多，更优选90%或更多，仍更优选95%或更多，更为优选97%或更多，最优选99%或更多的同源性。在本发明中，修饰基因组以便有关糖链修饰的酶活性的降低或消除超过其亲代细胞，所述的糖链中岩藻糖的I位通过α -键和复合体N-糖苷连接糖链的还原末端N-乙酰氨基葡萄糖的6位连接，其含义是突变被导入酶的表达控制区，以便减少这种酶的表达，或突变被导入基因的氨基酸序列中以便降低这种酶的功能。导入突变的含义是在基因组的核苷酸序列中进行修饰，如删除，取代，插入和/或添加。基因组基因被敲除的细胞的含义是在细胞中基因组基因的表达或功能完全被抑制。基因组基因被敲除的细胞包括从基因组中完全或部分删除目的基因的细胞。作为获得这种细胞的方法，可以使用任何技术，只要目的基因组能够被修饰。但优选遗传工程技术。例子包括(a) 一种基因破坏技术，包括靶向编码1，6-岩藻糖修饰酶的基因，(b)导入编码1，6-岩藻糖修饰酶显性负突变基因的技术，(C)将突变导入编码1，6_岩藻糖修饰酶的基因中的技术，(d)抑制编码α 1，6-岩藻糖修饰酶的基因转录和/或翻译的技术。而且，本发明的细胞可通过使用以下的方法获得，即通过使用选择对植物凝集素有抗性的克隆，所述凝集素可识别其中岩藻糖的I位通过α -键和复合体N-糖苷连接糖链的还原末端N-乙酰氨基葡萄糖的6位连接的糖链。
植物凝集素抗性细胞的生长不受细胞培养过程中植物凝集素有效浓度的抑制。有效浓度是亲代细胞不能正常生长的浓度，或高于该浓度亲代细胞不能生长的浓度，该浓度优选类似于亲代细胞不能正常生长的浓度，更优选是亲代细胞不能正常生长的浓度2至5倍，仍更优选至少是亲代细胞不能正常生长的浓度10倍，最优选高于亲代细胞不能正常生长的浓度至少20倍。在本发明中，不能抑制生长的植物凝集素的有效浓度可根据细胞系来决定，通常为 10 μ g/ml 至 10. Omg/ml,优选 O. 5 至 2. Omg/ml。作为凝集素，可以使用任何凝集素，只要它是可以识别岩藻糖的I位通过α键结合于N-糖苷键合的复合糖链还原性末端的N-乙酰葡糖胺6位的糖链的凝集素。例子包括小扁豆凝集素LCA (来源于Lens culinaris的扁豆凝集素),豌豆凝集素PSA (来源于Pisumsativum的豌豆凝集素),一种蚕豆凝集素VFA (来源于Vicia faba的凝集素)，陈皮木耳凝集素AAL (来源于Aleuria aurantia的凝集素)等等。本发明的细胞可以是任何细胞，只要其能够表达一种抗体分子。例子包括酵母、动物细胞、昆虫细胞、植物细胞和类似物，具体的例子包括在下面第3项中所描述的那些。动物细胞包括来自中国仓鼠卵巢组织的CHO细胞，大鼠骨髓瘤细胞系YB2/3HL. P2Gil. 16Ag. 20细胞，小鼠骨髓瘤细胞系NSO细胞，小鼠骨髓瘤SP2/0_Agl4细胞，来自叙利亚仓鼠肾组织的BHK细胞，产生抗体的杂交瘤细胞，人白血病细胞系Namalwa细胞，胚胎干细胞，受精卵细胞和类似细胞。优选的例子包括用于产生抗体组合物的上述骨髓瘤细胞和杂交瘤细胞，产生人源化抗体和人抗体的宿主细胞，制备可产生人抗体的非人转基因动物的胚胎干细胞和受精卵细胞，制备可产生人源化抗体和人抗体的转基因植物的植物细胞，和类似细胞。本发明的细胞产生的抗体组合物较亲代细胞所产生的抗体组合物的ADCC活性更闻。而且，本发明的细胞能够产生一种抗体组合物，其中在与组合物中Fe区结合的N-糖苷连接糖链总复合体中，岩藻糖不与糖链还原末端中N-乙酰氨基葡萄糖结合的糖链比例较亲代细胞产生抗体组合物高。本发明涉及一种产生抗体组合物的过程，其特征是使用本发明的细胞。抗体组合物是一种含有Fe区具有N-糖苷连接糖链复合体的抗体分子的组合物。抗体是一种四聚体，其中两条多肽链，重链(此后称为“H链”)和轻链(此后称为“L链”)中的两个分子分别是相连的。每个H链N-末端的大约四分之一和L链N-末端的大约四分之一(每个都超过100个氨基酸)称为V区，该区富有多样性，并直接与抗原的结合有关。V区以外部分的较大部分称为C区。根据C区的同源性，抗体分子分为IgG，IgM, IgA, IgD和IgE几型。同样，根据C区的同源性IgG型也进一步分为IgGl至IgG4亚型。H链从其N-末端侧分为四个免疫球蛋白区VH，CHl，CH2和CH3，和在CHl和CH2之间将CHl和CH2分开的高度可变的多肽区，称为铰链区。含有铰链区后的CH2和CH3的结构单位称为Fe区，N-糖苷连接糖链结合在上面，该区也是Fe受体，补体和类似物结合的区域(免疫学图册，原版，Nankodo, 2000年2月10日发行,第五版；抗体技术手册(Kotai KogakuNyumon) ,Chijin Shokan, 1994 年 I 月 25 日，第一版)。根据与蛋白质部分的结合形式，糖蛋白，如抗体的糖链粗略地分为两种类型，即与天冬酰胺(N-糖苷连接的糖链)结合的糖链和与其他氨基酸，如丝氨酸、苏氨酸(O-糖苷连接糖链)结合的糖链。N-糖苷连接糖链有一个基本的共同核心结构，由下面的结构式(I)表示[生物化学实验方法23-研究糖蛋白糖链的方法(Gakujutsu Shuppan中心)，Reiko Takahashi 主编(1989)]
权利要求
1.一种产生抗体组合物的方法，所述方法包括使用含有编码抗体分子的基因的细胞，其中细胞的基因组被修饰以使与糖链修饰相关的酶的活性比其亲代细胞更低或消失，所述糖链中岩藻糖的I位与N-糖苷连接的糖链复合体中还原端的N-乙酰氨基葡萄糖的6位通过α-键连接。
2.根据权利要求I所述的方法，其特征在于编码糖链修饰相关酶的基因组基因被敲除，所述糖链中岩藻糖的I位与N-糖苷连接的糖链复合体中还原端的N-乙酰氨基葡萄糖的6位通过α-键连接。
3.根据权利要求I所述的方法，其特征在于编码糖链修饰相关酶的基因组上的所有等位基因被敲除，所述糖链中岩藻糖的I位与N-糖苷连接的糖链复合体中还原端的N-乙酰氨基葡萄糖的6位通过α-键连接。
4.根据权利要求I所述的方法，其特征在于与糖链修饰相关的酶是α1，6-岩藻糖基转移酶，所述糖链中岩藻糖的I位与N-糖苷连接的糖链复合体中还原端的N-乙酰氨基葡萄糖的6位通过α -键连接。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述的α ，6-岩藻糖基转移酶是选自以下(a)至(d)的DNA编码的蛋白质 (a)含有SEQID NO: I所示的核苷酸序列的DNA; (b)含有SEQID NO:2所示的核苷酸序列的DNA; (c)在严格条件下，与包含SEQID NO: I所示的核苷酸序列的DNA杂交，并具有α 1，6-岩藻糖基转移酶活性的DNA; (d)在严格条件下，与包含SEQID N0:2所示的核苷酸序列的DNA杂交，并具有α 1，6-岩藻糖基转移酶活性的DNA。
6.根据权利要求4的方法，其特征在于所述的α ，6-岩藻糖基转移酶是选自以下(a)、(b)、(c)、(d)、(e)和⑴的蛋白质 (a)含有SEQID N0:4所示氨基酸序列的蛋白质； (b)含有SEQID N0:5所示氨基酸序列的蛋白质； (c)含有SEQID N0:4所示氨基酸序列中至少一个氨基酸被删除、取代、插入、和/或添加的氨基酸序列，并具有α ，6-岩藻糖基转移酶活性的蛋白质； (d)含有SEQID N0:5所示氨基酸序列中至少一个氨基酸被删除、取代、插入、和/或添加的氨基酸序列，并具有α ，6-岩藻糖基转移酶活性的蛋白质； (e)含有与SEQID N0:4所示氨基酸序列具有80%以上同源性的氨基酸序列，并具有α 1，6-岩藻糖基转移酶活性的蛋白质； (f)含有与SEQID NO:5所示氨基酸序列具有80%以上同源性的氨基酸序列，并具有α 1，6-岩藻糖基转移酶活性的蛋白质。
7.根据权利要求I所述的方法，其特征在于所述细胞对识别糖链的凝集素具有抗性，所述糖链中岩藻糖的I位与N-糖苷连接的糖链复合体中还原端的N-乙酰氨基葡萄糖的6位通过α-键连接。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述细胞对选自以下(a)至(d)的至少一种凝集素具有抗性 (a)小扁豆凝集素；(b)豌豆凝集素； (c)蚕豆凝集素； (d)陈皮木耳凝集素。
9.根据权利要求I所述的方法，其特征在于所述细胞选自以下(a)至(j) (a)来源于中国仓鼠卵巢组织的CHO细胞； (b)大鼠骨髓瘤细胞系YB2/3HL.P2. Gil. 16Ag. 20细胞; (c)小鼠骨髓瘤细胞系NSO细胞； (d)小鼠骨髓瘤细胞系SP2/0-Agl4细胞； (e)来源于叙利亚仓鼠肾组织的BHK细胞； (f)产生抗体的杂交瘤细胞； (g)人白血病细胞系Namalwa细胞； (h)胚胎干细胞； (i)受精卵细胞； (j)植物细胞。
10.根据权利要求I所述的方法，其特征在于所述的抗体分子选自以下的(a)至(d): (a)人抗体; (b)人源化抗体； (C)含(a)或(b)Fc区的抗体片段； (d)含(a)或(b)Fc区的融合蛋白质。
11.根据权利要求I所述的方法，其特征在于所述的抗体分子属于IgG型。
12.根据权利要求I所述的方法，其特征在于所述方法包括在培养基中培养细胞，在培养物中形成和积累抗体组合物；并从培养物中回收抗体组合物。
13.根据权利要求I至12任一项所述的方法，其特征在于所述抗体组合物是比其亲代细胞产生的抗体组合物具有更高抗体依赖性细胞介导细胞毒活性的抗体组合物。
14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于所述的具有更高抗体依赖性细胞介导细胞毒活性的抗体组合物比其亲代细胞产生的抗体组合物具有更高的糖链比例，所述糖链中岩藻糖不与Fe区结合的N-糖苷连接的糖链总复合体中糖链还原端的N-乙酰氨基葡萄糖连接。
15.根据权利要求14所述的方法，其特征在于所述的不与岩藻糖连接的糖链中，岩藻糖的I位不与N-糖苷连接的糖链复合体中还原端的N-乙酰氨基葡萄糖的6位通过α -键连接。
16.根据权利要求13所述的细胞，其特征在于所述的具有更高抗体依赖性细胞介导细胞毒活性的抗体组合物是与抗体组合物Fe区结合的N -糖苷连接的糖链总复合体中，岩藻糖不与还原端的N-乙酰氨基葡萄糖通过α -键连接的糖链比例是抗体组合物中与Fe区结合的N-糖苷连接糖链总复合体的20%以上。
17.根据权利要求13所述的细胞，其特征在于所述的具有更高抗体依赖性细胞介导细胞毒活性的抗体组合物是没有岩藻糖与糖链中还原端N-乙酰氨基葡萄糖连接的抗体组合物。
18.—种产生抗体组合物的方法，其特征在于包括培养转基因非人动物或植物；从培养的动物或植物中分离含有所导入的抗体分子的组织或体液；从分离的组织或体液中回收含所需抗体分子的抗体组合物，其中转基因非人动物或植物使用细胞产生，其中细胞的基因组被修饰以使与糖链修饰相关的酶的活性比其亲代细胞更低或消失，并且被导入编码抗体分子的基因，所述糖链中岩藻糖的I位与N-糖苷连接的糖链复合体中还原端的N-乙酰氨基葡萄糖的6位通过α-键连接。
19.一种产生抗体组合物的方法，其特征在于包括从转基因非人动物或植物或其后代中分离产生抗体的细胞；在培养基中培养分离的产生抗体的细胞，在培养物中形成和积累抗体组合物；以及从培养物中回收抗体组合物，其中转基因非人动物或植物或其后代使用细胞产生，其中细胞的基因组被修饰以使与糖链修饰相关的酶的活性比其亲代细胞更低或消失，并且被导入编码抗体分子的基因，所述糖链中岩藻糖的I位与N-糖苷连接的糖链复合体中还原端的N-乙酰氨基葡萄糖的6位通过α -键连接。
20.根据权利要求18或19所述的方法，其特征在于所述的抗体组合物是比基因组未被修饰的转基因非人动物或植物或其后代产生的抗体组合物具有更高抗体依赖性细胞介导细胞毒活性的抗体组合物。
21.根据权利要求20所述的方法，其特征在于所述的具有更高抗体依赖性细胞介导细胞毒活性的抗体组合物比基因组未被修饰的转基因非人动物或植物或其后代产生的抗体组合物具有较高比例的糖链，所述糖链中岩藻糖不与和抗体组合物Fe区结合的N -糖苷连接的糖链总复合体的还原端的N-乙酰氨基葡萄糖连接。
22.根据权利要求21所述的方法，其特征在于所述的糖链中岩藻糖的I位不与N-糖苷连接的糖链还原端位置的N-乙酰氨基葡萄糖的6位通过α -键连接。
23.根据权利要求20所述的方法，其特征在于所述的具有更高抗体依赖性细胞介导细胞毒活性的抗体组合物中岩藻糖不与还原端的N-乙酰氨基葡萄糖连接的糖链比例是抗体组合物中与Fe区结合的N-糖苷连接糖链总复合体的20%以上。
24.根据权利要求20所述的细胞，其特征在于所述的具有更高抗体依赖性细胞介导细胞毒活性的抗体组合物是糖链中没有岩藻糖与还原端的N-乙酰氨基葡萄糖连接的抗体组合物。
25.一种含有在Fe区具有N-糖苷连接糖链的抗体分子的抗体组合物，其特征在于具有岩藻糖不与和抗体组合物Fe区结合的N -糖苷连接的糖链总复合体的还原端的N-乙酰氨基葡萄糖连接的糖链。
26.根据权利要求25所述的抗体组合物，其特征在于所述的不连接岩藻糖的糖链是岩藻糖的I位不与N -糖苷连接的糖链复合体的还原端的N-乙酰氨基葡萄糖的6位通过α-键连接的糖链。
27.—种通过权利要求1，18和19任一项中所述的方法产生的抗体组合物。
28.含有根据权利要求25至27任一项中所述的抗体组合物作为活性成分的药物。
29.根据权利要求28所述的药物，其特征在于所述药物是以下疾病的诊断剂、预防剂或治疗剂肿瘤相关疾病、变态反应相关疾病、炎症相关疾病、自身免疫性疾病、心血管疾病、病毒感染相关疾病或细菌感染相关疾病。
30.权利要求25至27任一项的抗体组合物在生产根据权利要求28或29所述的药物中的应用。
全文摘要
本申请涉及基因组被修饰的细胞，所述的修饰使与糖链修饰相关的酶活性较其亲代细胞更降低或消失，在所述修饰中，N-糖苷连接的糖链复合体中岩藻糖的1位与还原端的N-乙酰氨基葡萄糖的6位在通过α-键连接，以及用该细胞产生抗体组合物的方法。
文档编号A61P37/00GK102911987SQ20121020159
公开日2013年2月6日 申请日期2003年4月9日 优先权日2002年4月9日
发明者大贯尚子, 佐藤光男, 森胜弘, 山野和也 申请人:协和发酵麒麟株式会社