专利名称：一种微量动物细胞基因组dna模板制备液及相应的dna模板制备方法
技术领域：
本发明属于分子生物学领域，涉及一种微量动物细胞基因组DNA模板制备液及相 应的DNA模板制备方法。
背景技术：
现有的动物细胞基因组DNA提取方法很多，包括酚氯仿抽提法等，提取过程由于 DNA纯化需要洗涤等过程而繁琐，而且由于DNA纯化的得率问题，需要细胞初始样本量较 多，因此一般需要抽取动物血样或采动物组织样，对动物造成伤害较大。市场上现有的微量 动物细胞基因组DNA提取试剂盒由于需要纯化柱子而价格昂贵，且过程也相对繁琐。
发明内容
本发明目的在于提供针对现有动物细胞基因组DNA提取存在的不足，提供一种微 量动物细胞基因组DNA模板制备液及相应的DNA模板制备方法。一种微量动物细胞基因组DNA模板制备液，该制备液由A液和B液以1:3_10的 体积比混合制得，其中所述的A液为Tris、(NH4)2SO4, MgCl2的混合溶液，三种试剂终浓度 均为0. 1-2. OM ；所述的B液为Triton和β -琉基乙醇的混合溶液，二种试剂终浓度均为 0. 1-2. 0%。。相应的DNA模板制备方法，依次包括如下步骤
(1)取上述微量动物细胞基因组DNA模板制备液，加入装有微量动物细胞的离心管或 PCR管中；
(2)将装有所述DNA模板制备液和动物细胞的离心管或PCR管95°C保温5分钟，16°C 保温5分钟；
(3)加入蛋白酶K溶液，该蛋白酶K终浓度为1.0-3.0mg/ml；
(4)55°C保温2小时或以上，95°C保温10分钟，16°C保温5分钟；
(5)离心取上清，此上清液直接用作PCR的DNA模板。所述的DNA模板制备方法优选依次包括如下步骤
(1)取上述微量动物细胞基因组DNA模板制备液8.8μ 1，加入装有动物细胞的离心管 或PCR管中；
(2)将装有所述DNA模板制备液和动物细胞的离心管或PCR管95°C保温5分钟，16°C 保温5分钟；
(3)加入浓度为10mg/ml蛋白酶K溶液1.2 μ 1，使该蛋白酶K终浓度为1.2mg/ml，得 到总反应体积10 μ 1 ；
(4)55°C保温2小时或以上，95°C保温10分钟，16°C保温5分钟；
(5)离心取上清，此上清液直接用作PCR的DNA模板。有益效果
3本发明微量动物细胞基因组DNA模板制备液成本较之现有的动物细胞基因组DNA提取 所需试剂成本大幅降低。本发明动物细胞基因组DNA模板制备过程简单，利用所配制的DNA 模板制备液直接将动物细胞裂解，释放的DNA无需进行纯化可直接用作常规PCR的DNA模 板，避免了常规方法提取基因组DNA的繁琐过程。由于模板制备过程简单，本发明从微量动 物细胞制备的基因组DNA模板完整，没有耗损。本发明微量动物细胞基因组DNA的模板制 备液及相应的DNA模板制备方法因所需初始动物细胞数量较小，可用于动物毛发毛囊、极 微量的动物培养细胞等基因组DNA模板的制备，使大规模动物细胞基因组DNA模板制备成 为可能。由于动物毛发等取样简单，较之动物血样或组织样等的取样手段，对动物的伤害更
图1、实施例3利用本发明制备乳鸽微量羽髓细胞基因组DNA模板及乳鸽雌雄鉴别 结果图，
M=Marker DL 2000。图2、实施例4利用本发明制备牛毛囊细胞基因组DNA模板的PCR鉴定结果图， M=Marker DL 2000。图3、实施例5利用本发明制备猪单个卵母细胞周边少量卵丘细胞基因组DNA模板 的PCR鉴定结果图，
M =Marker DL 2000，泳道1、2 基因组DNA扩增片段，泳道3、4 阴性对照。
具体实施例方式
实施例1微量动物细胞基因组DNA模板制备液的配制
A液Tris、(NH4)2SO4^MgCl2三种试剂溶于双蒸水，使其终浓度均为0. IM ； B液=Triton和β -巯基乙醇用双蒸水稀释，使其终浓度均为0. 1% ； 以双蒸水为溶剂，按常规方法分别配制A液和B液，然后以1:3的比例将Α、Β两种液体 混合均勻，即得动物细胞基因组DNA模板制备液。实施例2微量动物细胞基因组DNA模板制备液的配制
A液Tris、(NH4)2SO4^MgCl2三种试剂溶于双蒸水，使其终浓度均为2. OM ； B液=Triton和β -巯基乙醇用双蒸水稀释，使其终浓度均为2. 0% ； 以双蒸水为溶剂，按常规方法分别配制A液和B液，然后以1 10的比例将A、B两种液 体混合均勻，即得动物细胞基因组DNA模板制备液。实施例3利用乳鸽微量羽髓细胞制备基因组DNA模板及乳鸽雌雄鉴别 1. 1乳鸽羽髓细胞基因组DNA模板制备
拨取7天左右乳鸽新生腹侧羽毛(含少量羽髓)1根，并取Img左右羽髓于PCR管中； PCR管中加入实施例1微量动物细胞基因组DNA模板制备液8. 8 μ 1 ； PCR管置PCR仪中95°C 5分钟，16°C 5分钟，55°C 2小时，95°C 10分钟，16°C 5分钟。 并在第一个16°C 5分钟过种中暂停PCR仪，加入1.2 μ 1蛋白酶K (10mg/ml)； 离心取上清作PCR的DNA模板。1.2 PCR 扩增
4反应体系双蒸水 6. 05 μ l、25mM Mg2+ 1. 0μ IUOXBuffer 1· Ομ l、5mM dNTP 0. 4μ 1、 5μΜ上、下游引物各0. 5μ l、Taq酶0. 05μ 1、DNA模板0. 5μ 1 ；上游引物为:SEQ ID NO. 1， 下游引物为=SEQ ID NO. 2。反应条件94°C2 分钟；94°C 30 秒，50 °C 30 秒，72 °C 40 秒，35 个循环。1.3 PCR产物条带分型
EB染色，1%琼脂糖凝胶5-lOV/cm电泳，成像系统条带分型。雌性鸽为三条条带，长度 分别是628bp、420bp和358bp ；雄性鸽为二条条带，长度分别为628bp和358bp (见图1)。实施例4利用牛毛囊细胞制备基因组DNA模板 1. 1种公牛毛囊细胞基因组DNA模板制备
拨取种公牛毛发1根，并取毛囊于PCR管中； PCR管中加入实施例2微量动物细胞基因组DNA模板制备液8. 8 μ 1 ； PCR管置PCR仪中95°C 5分钟，16°C 5分钟，55°C 2小时，95°C 10分钟，16°C 5分钟。 并在第一个16°C 5分钟过种中暂停PCR仪，加入1.2 μ 1蛋白酶K (10 mg/ml)； 离心取上清作PCR的DNA模板。1.2 PCR 扩增
反应体系双蒸水 6. 05 μ l、25mM Mg2+ 1. Ομ IUOXBuffer 1· 0μ l、5mM dNTP 0. 4μ 1、 5μΜ所述的上、下游引物各0. 5μ l、Taq酶0. 05μ 1、DNA模板0. 5μ 1 ；上游引物为SEQ ID NO. 3，下游引物为=SEQ ID NO. 4。反应条件94°C2 分钟；94°C 30 秒，56 °C 30 秒，72 °C 40 秒，35 个循环。1.3基因组DNA模板的PCR鉴定
EB染色，1%琼脂糖凝胶5-lOV/cm电泳，成像系统鉴定PCR扩增产物条带(见图2)。实施例5利用猪单个卵母细胞周边少量卵丘细胞制备基因组DNA模板 1. 1单个卵母细胞周边的少量卵丘细胞基因组DNA模板制备
吸取单个卵母细胞(含少量卵丘细胞)，并吹入PCR管中(PBS尽量少)； PCR管中加入实施例2微量动物细胞基因组DNA模板制备液8. 8 μ 1 ； PCR管置PCR仪中95°C 5分钟，16°C 5分钟，55°C 2小时，95°C 10分钟，16°C 5分钟。 并在第一个16°C 5分钟过种中暂停PCR仪，加入1.2 μ 1蛋白酶K (10mg/ml)； 离心取上清作PCR的DNA模板。1.2 PCR 扩增
反应体系双蒸水 6. 05 μ l、25mM Mg2+ 1. 0μ IUOXBuffer 1· 0μ l、5mM dNTP 0. 4μ 1、 5μΜ所述的上、下游引物各0. 5μ l、Taq酶0. 05μ 1、DNA模板0. 5μ 1 ；上游引物为SEQ ID NO. 5，下游引物为=SEQ ID NO. 6。反应条件94°C2 分钟；94°C 30 秒，59 °C 30 秒，72 °C 30 秒，35 个循环。1.3基因组DNA模板的PCR鉴定
EB染色，1%琼脂糖凝胶5-lOV/cm电泳，成像系统鉴定PCR扩增产物条带(见图3)。
权利要求
一种微量动物细胞基因组DNA模板制备液，其特征在于该制备液由A液和B液以1:3 10的体积比混合制得，其中所述的A液为Tris、(NH4)2SO4、MgCl2的混合溶液，三种试剂终浓度均为0.1 2.0M；所述的B液为Triton和β 琉基乙醇的混合溶液，二种试剂终浓度均为0.1 2.0%。
2.—种DNA模板制备方法，其特征在于依次包括如下步骤(1)取权利要求1所述的微量动物细胞基因组DNA模板制备液，加入装有微量动物细 胞的离心管或PCR管中；(2)将装有所述DNA模板制备液和动物细胞的离心管或PCR管于95°C保温5分钟， 16°C保温5分钟；(3)加入蛋白酶K溶液，使该蛋白酶K终浓度为1.0-3.0mg/ml；(4)55 °C保温2小时或以上，95°C保温10分钟，16°C保温5分钟；(5)离心取上清，此上清液直接用作PCR的DNA模板。
3.根据权利要求2所述的DNA模板制备方法，依次包括如下步骤(1)取权利要求1所述的微量动物细胞基因组DNA模板制备液8.8 μ 1，加入装有微量 动物细胞的离心管或PCR管中；(2)将装有所述DNA模板制备液和动物细胞的离心管或PCR管于95°C保温5分钟， 16°C保温5分钟；(3)加入浓度为10mg/ml蛋白酶K溶液1.2 μ 1，使该蛋白酶K终浓度为1. 2mg/ml，得 到总反应体积10 μ 1 ；(4)55°C保温2小时或以上，95°C保温10分钟，16°C保温5分钟；(5)离心取上清，此上清液直接用作PCR的DNA模板。
全文摘要
本发明属于分子生物学领域，公开了一种微量动物细胞基因组DNA模板制备液及相应的DNA模板制备方法。微量动物细胞基因组DNA模板制备液由A液和B液以1:3-10的体积比混合制得，A液为Tris、(NH4)2SO4、MgCl2的混合溶液，三种试剂终浓度分别为0.1-2.0M；所述的B液为Triton和β-琉基乙醇的混合溶液，二种试剂终浓度分别为0.1-2.0%。本发明微量动物细胞基因组DNA模板制备液成本较之现有的基因组DNA提取所需试剂的提取成本大幅降低；由于模板制备过程简单，所制备的基因组DNA模板完整，没有耗损，可确保细胞基因组DNA模板制备的一次性成功。
文档编号C12N15/10GK101948828SQ201010507070
公开日2011年1月19日 申请日期2010年10月14日 优先权日2010年10月14日
发明者夏银, 王根林, 邢光东 申请人:江苏省农业科学院