一种溪蟹单细胞悬液的制备方法
【专利摘要】本发明提供了一种溪蟹单细胞悬液的制备方法，其步骤为：将溪蟹组织切成碎片，放入5-10℃、pH7.0-7.5的PBS溶液中，加入胰蛋白酶，进行酶解，用100-200目细胞筛过滤，酶液在8-12℃、800-1000rpm离心1-2分钟，去上清后，沉淀用PBS洗涤两次，即可。本发明操作简单，它能将溪蟹的组织细胞完全分离得到单细胞悬液，并且成活率达到95%以上。利用本方法分离得到的单细胞可以直接进行细胞体外培养及单细胞实验。
【专利说明】一种溪蟹单细胞悬液的制备方法【技术领域】
[0001]本发明涉及动物单细胞悬液的制备，具体是一种溪蟹单细胞悬液的制备方法。
【背景技术】
[0002]动物细胞与完整动物组织和个体一样具有相同的生理反应能力，能感受各种激素、代谢物、环境信号和病原体诱导子等刺激，并对各种刺激做出相应生理反应。结合现代的遗传学、基因组学和转基因技术方法，将外援基因导入细胞，通过短时间外援基因表达确定基因的功能，进一步阐述动物的信号转导途径。利用动物细胞表达体系为基因表达的调控提供了一种方便而有效的实验系统，其优点在于体外分离培养的细胞是一个相对比较均一的单细胞群体，导入外源基因后的表达有较好的同步性；其次不需要进行长时间的组织培养。动物细胞及表达系统已被广泛应用于研究，如激素以及干旱、重金属、紫外等多种生物和非生物胁迫对细胞损伤、基因表达、蛋白的定位和功能的影响。在细胞生物学与分子生物学领域中，荧光素或荧光蛋白基因常被用作一个报告基因，通过荧光显微镜、激光共聚焦扫描显微镜和流式细胞仪分析，可以原位跟踪各种分子、特定基因在逆境和发育过程时空上的特意表达，定量分析目的基因的表达水平，显示其在细胞内的表达位置和量的变化，为探讨该基因在细胞中的作用及分子机制提供便利条件。目前对动物单细胞分离和培养多集中在人类的细胞株和细胞系的培养，这些细胞分离和细胞培养的建立，为临床研究各种生理机制提供良好模型，为研究提供了一定的途径。但有关较低等的无脊椎动物，相关的细胞分离技术和培养还未有发现。河南华溪蟹属节肢动物门、甲壳纲、软甲亚纲、囊甲总目、十足目、爬行亚目、短尾部、溪蟹总科、溪蟹科、华溪蟹属，常年生活在水体基底层，直接面对水体污染。大量水体污染物可以通过呼吸、消化和皮肤渗透等作用进入体内影响溪蟹的正常生长和发育。目前，以溪蟹为材料进行相关的毒理研究也取得了一定的进展，但研究多集中于组织水平，而细胞水平的研究都因无法得到大量的、成活率高的单细胞悬液而成为进一步科学研究的瓶颈。
【发明内容】
[0003]本发明的目的是建立一种简便，易行，分离效果好、成活率高的溪蟹单细胞悬液的制备方法，从而为无脊椎动物细胞培养和细胞水平的研究提供可能的技术条件。
[0004]本发明提供的一种溪蟹单细胞悬液的制备方法，其原理为动物细胞间主要通过果胶质连接，利用胰蛋白酶的水解作用，首先将组织剪成0.5mm2的切片，使胰蛋白酶液进入到组织间隙中进行溶解细胞间的连接，最终将细胞分离。
[0005]本发明提供的一种溪蟹单细胞悬液的制备方法，包括如下步骤:
[0006]剖取溪蟹组织，在不破坏细胞完整性的情况下，将组织切成0.5-lmm2的碎片，放入5-10。。、pH 7.0-7.5的PBS溶液中，加入胰蛋白酶至浓度为2.0-3.0%，酶液在8-12。。(酶解温度优选10°C)下10-20.转/分钟的摇床上酶解5-15分钟，用100-200目细胞筛过滤，800-1000rpm离心1_2分钟，去上清后，沉淀用PBS洗涤两次，即可得到溪蟹单细胞悬液。[0007]利用上述方法得到的溪蟹单细胞悬液可进行细胞的体外培养、传代培养和细胞水平的分析研究。如:利用单细胞凝胶电泳进行彗星实验，利用流式细胞仪、荧光显微镜和激光共聚焦显微镜等仪器并结合荧光素及荧光蛋白等对生物大分子进行亚细胞定位、定量及功能分析实验。
[0008]与现有分离方法相比，已有的单细胞分离方法多只对于哺乳动物或植物，对于无脊椎动物溪蟹，尤其是鳃、肝胰腺等组织的单细胞分离技术还没有报道。本方法能非常好的将不同组织分离成单细胞，分离效果良好；而且单细胞的成活率可达到95%以上。利用本发明所得到的单细胞悬液再结合萤光素F1UO-3AM可用于对细胞中Ca2+浓度的变化进行检测。
【专利附图】
【附图说明】
[0009]图1:河南华溪蟹鳃单细胞显微镜观察图(放大倍数100 X )
[0010]图2 =CdCl2处理前后溪蟹鳃单细胞中钙离子浓度变化图。其中:
[0011]A1、A2分别为CdCl2处理前和处理30分钟后荧光显微镜下溪蟹鳃单细胞细胞中钙离子的浓度变化图。
[0012]BUB2分别为CdCl2处理前和处理30分钟后激光共聚焦显微镜下溪蟹鳃单细胞细胞中钙离子的浓度变化图。
[0013]图3:河南华溪蟹肝胰腺单细胞显微镜观察图(放大倍数400X )。其中:·[0014]B为分泌细胞；E为胚细胞；F为吸收细胞；R为储藏细胞；LD为脂肪滴。
【具体实施方式】
[0015]以下给出本发明的实施例。
[0016]实施例1
[0017]取成年溪蟹一只，用锋利剪刀将溪蟹头胸甲剪开，露出位于鳃腔两侧的鳃丝，用镊子从鳃丝基部取鳃丝，沿着鳃轴的垂直和平行的方向将鳃片切成0.5mm2的碎片，放入10°C、pH 7.2的PBS溶液中，加入胰蛋白酶至终浓度为2.5%，在10°C下10转/分钟的摇床上酶解10分钟，用200目细胞筛过滤，IOOOrpm离心酶液2分钟，去上清后，沉淀用PBS洗涤两次，即可得到溪蟹鳃单细胞悬液。用台盼蓝染色，在显微镜下观察，无色细胞为活细胞，蓝色细胞为死细胞。如图1所示，死细胞个数为O,活细胞个数为35,成活率=活细胞数目/细胞总数=100%。
[0018]实施例2
[0019]取实施例1制备的新鲜单细胞悬液，加入能与Ca2+特异结合的荧光素Fluo-3AM孵育30分钟，用PBS洗涤2次，将细胞浓度调整后用2.9mg/LCdCl2处理细胞，30分钟用荧光显微镜和激光共聚焦显微镜观察(见图2)。细胞中Ca2+浓度低，Fluo-3与Ca2+不结合，荧光显微镜下细胞没有绿色荧光；Ca2+浓度升高，Fluo-3与Ca2+结合，荧光显微镜下细胞发出绿色荧光，绿色荧光越强，Ca2+越高。Al是CdCl2未处理细胞，细胞Ca2+低，细胞没有荧光；A2是CdCl2处理30分钟后，细胞中Ca2+浓度升高，细胞绿色荧光明显增强。BI是CdCl2未处理细胞，细胞Ca2+低，激光共聚焦显微镜下细胞没有荧光；B2是CdCl2处理30分钟后，细胞中Ca2+浓度升高，激光共聚焦显微镜下细胞绿色荧光明显增强。
[0020]实施例3[0021 ] 取成年溪蟹一只，用锋利剪刀将溪蟹头胸甲剪开，用镊子取肝胰腺，将腺管横切成
0.长度的碎片，放入10°C、pH 7.2的PBS溶液中，加入胰蛋白酶至终浓度为2.0%，
在10°C下10转/分钟的摇床上酶解5分钟，用100目细胞筛过滤，IOOOrpm离心酶液1.5分钟，去上清后，沉淀用PBS洗涤两次，即可得到溪蟹肝胰腺单细胞悬液。用台盼蓝染色，在显微镜下观察，无色细胞为活细胞，蓝色细胞为死细胞。如图3所示，死细胞个数为0，活细胞个数为47,成活率=活细胞数目/细胞总数=100`%。
【权利要求】
1.一种溪蟹单细胞悬液的制备方法，其特征在于，包括如下步骤:剖取溪蟹组织，在不破坏细胞完整性的情况下，将组织切成0.5-lmm2的碎片，放入5_10°C、pH 7.0-7.5的PBS溶液中，加入胰蛋白酶至终浓度为2.0-3.0%，酶液在8-12°C下10-20转/分钟的摇床上酶解5-15分钟，用100-200目细胞筛过滤，800-1000rpm离心1_2分钟，去上清后，沉淀用PBS洗涤两次，即可得到溪蟹单细胞悬液。
2.如权利要求1所述的一种溪蟹单细胞悬液的制备方法，其特征在于，所述的酶液的酶解温度为10 °C。
【文档编号】C12N5/07GK103436487SQ201310406493
【公开日】2013年12月11日 申请日期:2013年9月9日 优先权日:2013年9月9日
【发明者】王金香, 王兰, 刘娜, 落继先, 王茜, 井维鑫 申请人:山西大学