一种促红细胞生成素模拟肽衍生物、其制备方法和用图

一种促红细胞生成素模拟肽衍生物、其制备方法和用图
【专利摘要】本发明涉及一种具有长效促红细胞生成功能的促红细胞生成素模拟肽衍生物及其可药用盐。本发明还提供了上述促红细胞生成素模拟肽衍生物的制备方法以及其在用于制备治疗以缺乏红细胞缺乏红细胞生成素或红细胞群缺少或缺陷为特征的疾病的药物中的用途。其中，本发明提供的促红细胞生成素模拟肽衍生物由SEQ ID NO:1所示的单体肽或通过单体肽末端的赖氨酸(K)侧链游离氨基形成的多聚体；其中，所述多聚体中每个单体肽的两个半胱氨酸形成二硫键，所述多聚体中单体肽的个数为2-10个。
【专利说明】
一种促红细胞生成素模拟肽衍生物、其制备方法和用途
技术领域
[0001] 本发明属于生物医学领域，涉及一种促红细胞生成素模拟肽衍生物，具体地说，本 发明涉及一种能够和促红细胞生成素受体结合并激活促红细胞生成素受体或者能起促红 细胞生成素激动作用的促红细胞生成素模拟肽衍生物及其制备方法，本发明还涉及所述模 拟肽衍生物在制备治疗以缺乏红细胞生成素为特征或以红细胞群缺少或缺陷为特征的疾 病的药物中的用途。
【背景技术】
[0002] 促红细胞生成素（erythropoietin，ΕΡ0)是一种糖蛋白激素，分子量约34kD。血 浆中存在的促红细胞生成素由165个氨基酸组成，糖基化程度很高，糖的成分主要是唾液 酸。根据碳水化合物含量不同，天然存在的促红细胞生成素分为两种类型即α型和β 型，其中，α型含34%的碳水化合物，β型含26%的碳水化合物。两种类型在生物学特 性、抗原性及临床应用效果上均相同。人类促红细胞生成素基因位于7号染色体长22区。 1985年其cDNA被成功克隆，并利用基因重组技术开始大批量生产重组人促红细胞生成 素 （recombinant human erythropoietin, rHuEPO)，广泛用于临床。应用重组 DNA 技术已 经生物合成出促红细胞生成素（Egrie，JC，Strickland, TW，Lane，J等（986)免疫生物学 (Immun〇bi〇l)72:213-224)，其是插入到中国仓鼠的卵巢组织细胞（CH0细胞）中并且表达 的克隆的人促红细胞生成素基因的产物。天然存在的人促红细胞生成素首先翻译成含有 166个氨基酸并且166位是精氨酸的多肽链。在翻译后修饰中，用羟肽酶裂解掉166位精氨 酸。没有糖基的人ΕΡ0的多肽链的分子量是18236Da，在完整的促红细胞生成素分子中，糖 基占整个分子量的大约40% (J. Biol. Chem. 262:12059)。
[0003] 促红细胞生成素是最早应用于临床的细胞因子，是迄今所知作用最单一、且安全 可靠的升血红蛋白制剂。对于肾贫血、再生障碍性贫血、多发性骨髓瘤及阵发性夜间血尿等 均有一定疗效；此外，应用促红细胞生成素还可减少手术中的输血量，并能在一定程度上纠 正由恶性肿瘤、化疗及类风湿性关节炎引起的贫血。由于促红细胞生成素主要由肾小管内 皮细胞产生，肾性疾患引起的贫血是促红细胞生成素的首选适应证；促红细胞生成素纠正 肾性贫血的疗效几乎100%，但并不能改善肾功能。促红细胞生成素的治疗安全、有效，适合 长期治疗，也能避免血源紧张。在2006年的全球生物技术药市场上，促红细胞生成素类的 重组药物占了 119亿美元，有巨大的市场容量。
[0004] 早在1989年，美国FDA就正式批准重组人促红素（EP0GEN)用于肾性贫血的治疗， 但直到1992年才在我国上市。我国慢性肾炎的年发病率约为0. 25%，其中相当一部分患者 最终会转为肾衰，每年的肾性贫血患者约50-60万。根据保守的用药量估算，如果按当前的 价格30-40元/支，加上癌症相关性贫血等其他病人的用药，国内市场容量约12-16亿元甚 至更大（病人平均体重按50Kg计算）。自20世纪90年代后期，促红细胞生成素已进入我 国重点城市医院畅销药品行列，2003年在全国重点城市样本医院用药金额6213万元，排名 第56位。2004年，全国重点城市样本医院购药金额增长到8049万元，同比增长了 30%。
[0005] 促红细胞生成素作为一种作用于骨髓造血细胞，促进红系祖细胞增生、分化，最终 成熟的内分泌激素，对机体供氧状况发挥重要的调控作用。在胚胎早期，促红细胞生成素由 肝生成，然后逐渐向肾转移，出生后主要由肾小管间质细胞分泌。
[0006] 在促红细胞生成素诱导红组细胞分化过程中，球蛋白被诱导，这能使细胞吸收更 多的铁合成功能性的血红蛋白，这种功能性的血红蛋白可以和成熟的红血球中的氧结合， 因此，红血球和血红蛋白在提供机体氧方面扮演了极其重要的角色。这一过程是由促红细 胞生成素与红组细胞的表面受体之间的相互作用引起的。
[0007] 当人体处于健康状态时，组织可以从已经存在的红血球中吸收足够多的氧，此时 体内的促红细胞生成素浓度很低，这种正常的较低的促红细胞生成素浓度完全可以刺激促 进由于年龄的问题而正常损失的红细胞。当循环系统中的依靠红细胞进行氧输送的水平被 降低进而出现缺氧情况时，促红细胞生成素在体内的数量将会增加，机体缺氧状态可以由 以下原因引起的：过量的辐射、因高炜度或长期昏迷造成的氧摄入量减少、各种类型的贫血 等等。作为对组织处于缺氧压力的应答，促红细胞生成素水平的提高可以刺激红组细胞的 分化达到提高红细胞生成的能力。当体内的红细胞的数量大于正常组织的需求时，循环系 统中促红细胞生成素的水平被降低。正是由于促红细胞生成素对于红细胞的生成有着至关 重要的作用，因此这类激素对于治疗和诊断以红细胞生成低下和缺陷为特征的血液病方面 有着很广泛的前景。最近的研究为推测促红细胞生成素疗法在多种疾病、紊乱和血液学异 常情况中的效用提供了基础，这些疾病包括：慢性肾衰竭（CRF)患者贫血症的治疗中使用 促红细胞生成素和在艾滋病和接受化疗的癌症患者贫血症的治疗中使用促红细胞生成素 (Danna, RP，Rudnick，SA，Abels，RI，于：MB，Garnick编著，临床应用中的促红细胞生成素一 国际展望（Erythropoietin in Clinical Applications-An International Perspective. Marcel Dekker ; 1990:p301_324)。
[0008] 促红细胞生成素的部分生物学效应可以通过和细胞膜表面的受体内在作用来 调节。起先，使用从小鼠的脾脏里分离出的未成熟的红细胞来研究细胞表面结合的促 红细胞生成素蛋白时发现，这种蛋白是由两种多聚肽组成，其分子量大约为85000~ 100000KD (Sawyer, et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:3690-3694)由比较详细的 叙述。促红细胞生成素的结合位点的数目也被计算出来了，大约每个细胞膜含有800~ 1000个位点。在这些结合位点中大约有300个结合位点的Kd水平为90pM，而剩下的结合 位点的结合力比较弱，大约有570pM。有研究表明从感染了 friend病毒贫血株的小鼠的脾 脏红细胞对ΕΡ0的响应情况发现，大约有400个结合位点，其中Kd水平高的为100pM，Kd水 平低的为800pM。
[0009] 随后的工作就是两种促红细胞生成素受体被单个基因翻录，这个基因已经被克 隆。例如，小鼠和人的促红细胞生成素受体的DNA序列以及编码肽的序列在W090/08822中 已经有叙述。目前的模型表明促红细胞生成素结合到促红细胞生成素受体导致了两个促红 细胞生成素受体的活化和二聚，这种二聚进一步导致了信号传导的开始。
[0010] 促红细胞生成素克隆基因的应用更有助于帮助寻找这些重要受体的激动剂和拮 抗剂。某种程度上能够作用促红细胞生成素受体的肽已经被确定和叙述。特别是确定了一 组含有主要肽段的肽，这些肽可以和促红细胞生成素受体结合并能刺激促红细胞生成素细 胞的分化增殖。但是能够刺激红细胞增殖分化的肽的EC50却很低，在20nM和250nM之间， 因此这些肽在临床应用上受到了较大的限制。

【发明内容】

[0011] 为了克服现有技术的不足，本发明提供了一种生物活性更好、生物利用度更高的 促红细胞生成素模拟肽衍生物及其可药用盐以及它们的制备方法。
[0012] 一方面，本发明的目的是提供一种具有长效促红细胞生成功能的促红细胞生成素 模拟肽衍生物及其可药用盐。
[0013] 再一方面，本发明还提供了本发明的促红细胞生成素模拟肽衍生物的制备方法以 及其在用于制备治疗以缺乏红细胞生成素为特征或以红细胞群缺少或缺陷为特征的疾病 的药物中的用途。
[0014] 本发明的又一方面还提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含本发明的促红 细胞生成素模拟肽衍生物。
[0015] 优选地，本发明的药物组合物为注射剂；更优选地，本发明的药物组合物为冻干粉 针或溶液注射剂。
[0016] 在一个优选实施方案中，本发明的药物组合物还包含药学上可接受的辅料成分。
[0017] 本发明提供了一种具有体内生物活性的促红细胞生成素模拟肽衍生物及其可药 用盐，其中，所述模拟肽衍生物为SEQ ID N0:1所示的单体肽或其多聚体；
[0018] SEQ ID N0:1 KGLYACHMGPIXJCQPLRX# ;
[0019] 其中，所述单体肽中，两个半胱氨酸（C)形成分子内二硫键，\表示Nal氨基酸，X2表示Sar氨基酸；
[0020] 所述多聚体是由SEQ ID NO: 1中的赖氨酸（K)通过侧链游离氨基形成的多聚体；
[0021] 其中，所述多聚体中每个单体肽的两个半胱氨酸形成二硫键，所述多聚体中单体 肽的个数为2-10个，即所述多聚体中单体肽的个数为2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、 9个或10个。
[0022] 其中，所述二聚体的结构式为：
[0023]
[0024] 所述三聚体的结构式为：
[0025]
[0026] 所述多聚体中单体肽个数为4-10个时，结构通式如式I所示：
[0027] 其中，η为4-10之间的整数；
[0028]
[0029] 式 I
[0030] 本发明还提供了所述促红细胞生成素模拟肽衍生物或其可药用盐的制备方法，所 述方法包括以下步骤：
[0031] 当所述促红细胞生成素模拟肽衍生物为单体肽时，根据SEQ ID NO: 1选择氨基酸， 使用Fmoc固相多肽合成法合成单体肽；
[0032] 当所述促红细胞生成素模拟肽衍生物为多聚体时，根据SEQ ID NO: 1选择氨基酸， 使用Fmoc固相多肽合成法合成单体肽，然后通过单体肽赖氨酸侧链上游离的氨基偶联，将 单体肽聚合为多聚体；
[0033] 任选地，将得到的单体肽或多聚体成盐。
[0034] 优选地，所述多聚体是通过包括以下步骤的方法实现的：
[0035] 首先，采用DDE保护赖氨酸，使用Fmoc固相多肽合成法合成单体肽后，采用DDE专 用脱保护剂脱去赖氨酸的DDE基团，然后利用赖氨酸侧链上游离的氨基进行第二条多肽的 合成，并以此类推合成多聚体。
[0036] 其中，本发明所述的Fmoc固相多肽合成方法是指以聚合物树脂作为固相反应基 质，将氨基端Fmoc保护的氨基酸在偶联试剂的存在下依次缩合，从而合成单体肽的合成方 法。
[0037] 优选地，所述制备方法还包括将制得的多聚体纯化，经脱盐及冷冻干燥得到多肽 冻干粉的步骤；优选地，所述纯化使用HPLC C18半制备柱进行，流动相为乙腈。
[0038] 本发明提供的促红细胞生成素模拟肽衍生物通过公知技术可使用酸性或碱性化 合物与之反应成盐，通常采用的形成酸加成盐的酸为：盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硫酸、磷酸、对 甲苯磺酸、甲磺酸、草酸、对溴苯基磺酸、碳酸、琥珀酸、柠檬酸、苯甲酸、乙酸。
[0039] 优选地，所述促红细胞生成素模拟肽衍生物的可药用盐选自硫酸盐、焦硫酸盐、三 氟乙酸盐、亚硫酸盐、亚硫酸氢盐、磷酸盐、磷酸氢盐、磷酸二氢盐、偏磷酸盐、焦磷酸盐、盐 酸盐、溴化物、碘化物、乙酸盐、丙酸盐、辛酸盐、丙烯酸盐、甲酸盐、异丁酸盐、己酸盐、庚酸 盐、丙炔酸盐、草酸盐、丙二酸盐、丁二酸盐、辛二酸盐、富马酸盐、马来酸盐、丁炔-1，4-二 酸盐、己炔-1，6-二酸盐、苯甲酸盐、氯苯甲酸盐、甲基苯甲酸盐、二硝基苯甲酸盐、羟基苯 甲酸盐、甲氧基苯甲酸盐、苯乙酸盐、苯丙酸盐、苯丁酸盐、柠檬酸盐、乳酸盐、γ-羟基丁酸 盐、甘醇酸盐、酒石酸盐、甲磺酸盐、丙磺酸盐、奈-1-磺酸盐、奈-2-磺酸盐和扁桃酸盐等， 优选三氟乙酸盐。
[0040] 碱性化合物也可以和促红细胞生成素模拟肽衍生物成盐，这些碱性化合物包括 铵，碱金属或碱土金属的氢氧化物，以及碳酸盐、碳酸氢盐，典型的有氢氧化钠、氢氧化钾、 氢氧化铵、碳酸钠、碳酸钾等。
[0041] 本发明还提供了所述促红细胞生成素模拟肽衍生物在制备用于治疗以缺乏红细 胞生成素为特征或以红细胞群缺少或缺陷为特征的疾病的药物中的应用。
[0042] 优选地，所述以缺乏红细胞生成素为特征或以红细胞群缺少或缺陷为特征的疾病 选自末期肾功能衰竭或透析；AIDS相关性贫血，自身免疫性疾病，或恶性肿瘤；囊性纤维变 性；早期早熟性贫血；与慢性炎性疾病相关的贫血；脊髓损伤；急性失血；衰老和伴有异常 红细胞产生的肿瘤疾病。
[0043] 本发明还提供了一种含上述促红细胞生成素模拟肽衍生物及其药用盐的药物组 合物，所述药物组合物用于治疗以缺乏红细胞生成素为特征或以红细胞群缺少或缺陷为特 征的疾病。
[0044] 本发明的药物组合物包括一种或多种药学上可接受的辅料，所述辅料选自水溶性 填充剂、pH调节剂、稳定剂、注射用水和渗透压调节剂中的一种或多种。
[0045] 本发明所述的水溶性填充剂辅料选自以下的一种或多种：甘露醇、低分子右旋糖 苷、山梨醇、聚乙二醇、葡萄糖、乳糖和半乳糖。
[0046] 所述pH调节剂选自以下的一种或多种：枸橼酸、磷酸、乳酸、酒石酸、盐酸等非挥 发性的酸，以及氢氧化钾、氢氧化钠或氢氧化铵、碳酸钠、碳酸钾、碳酸铵盐、碳酸氢钠、碳酸 氢钾或碳酸氢铵盐等生理可接受的有机或无机酸、碱或盐等。
[0047] 所述稳定剂选自以下的一种或多种：EDTA_2Na、硫代硫酸钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸 钠、磷酸氢二钾、碳酸氢钠、碳酸钠、精氨酸、谷氨酸、聚乙二醇6000、聚乙二醇4000、十二烷 基硫酸钠或三羟甲基氨基甲烷等。优选为焦亚硫酸钠、磷酸氢二钾、精氨酸、聚乙二醇6000 和三羟甲基氨基甲烷。
[0048] 所述渗透压调节剂为氯化钠和/或氯化钾。
[0049] 本发明的药物组合物可以通过肌肉、静脉内、皮下注射途经进行给药，优选的剂型 为冻干粉或溶液注射剂。
[0050] 冷冻干燥注射剂的制备方法：取促红细胞生成素模拟肽衍生物溶液适量，加入水 溶性填充剂、稳定剂、渗透压调节剂等，加入注射用水适量，调节pH值至4-8使其溶解，加水 稀释至适当浓度，加入0. 1-0. 5%活性炭，在0-KTC下搅拌10-20分钟，脱碳，采用微孔滤膜 过滤除菌，滤液进行分装，采用冷冻干燥法，制得白色疏松块状物，封口即得，每个规格分别 含有的促红细胞生成素模拟肽衍生物5 μ g，100 μ g以及lmg。
[0051] 注射液的制备方法：取促红细胞生成素模拟肽衍生物溶液或冻干粉适量，加入水 溶性填充剂、稳定剂、渗透压调节剂等，加入注射用水适量，调节pH值至4-8使其溶解，加水 稀释至适当浓度，加入0. 1-0. 5%活性炭，在0-KTC下搅拌10-20分钟，脱碳，采用微孔滤 膜过滤除菌，滤液进行分装，封口即得，每个规格分别含有的促红细胞生成素模拟肽衍生物 5 μ g，100 μ g 以及 lmg。
[0052] 本发明的药物组合物可以通过肌肉、静脉内、皮下注射途经进行给药，优选的剂型 为冻干粉或溶液注射剂。虽然剂量依治疗对象、给药方式、症状及其它因素而改变，本发明 的组合物在相当宽的剂量范围内是有效的。在成人的治疗中，剂量范围在50 μ g/人-10mg/ 人，每日一次或每几日一次给药。实际剂量应该由医生根据有关的情况来决定，这些情况包 括被治疗者的身体状态、给药途径、年龄、体重、患者对药物的个体反应，患者症状的严重程 度等等，因此上述剂量范围并不是以任何方式限制本发明的范围。
[0053] 与现有技术相比，本专利涉及的促红细胞生成素模拟肽及其可药用盐能够明显刺 激小鼠外周血网织红细胞计数的升高，说明它们刺激红细胞生成，同时还能够大大延长药 物在体内的半衰期。促红细胞生成素模拟肽衍生物和促红细胞生成素蛋白对成熟的红细 胞、血细胞压积、血红蛋白含量没有明显的影响，对外周血白细胞计数液没有明显影响。
【具体实施方式】
[0054] 下面结合【具体实施方式】对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐 明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
[0055] 在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。
[0056] 实施例1促红细朐牛成素樽拟肽衍牛物的合成
[0057] 以下结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。
[0058] 本发明的促红细胞生成素模拟肽衍生物为多聚体，其中单体的制备使用Fmoc固 相多肽合成方法，使用CSBio公司生产的CS 336X型仪器进行本发明的多肽的合成。合成的 方法按照生产商的仪器说明书进行。本文所述的Fmoc固相多肽合成方法是指以聚合物树 脂作为固相反应基质，将氨基端Fmoc保护的氨基酸在偶联试剂的存在下依次缩合，从而合 成多肽的合成方法。其具体方法参见Fmoc solid phase peptide synthesis:a practical approach, 2000, Oxford University Press。并通过氧化方法形成单体内二硫键，例如20% DMS0氧化法以及碘氧化法。将制得的多肽使用HPLC C18半制备柱进行纯化，流动相为乙 腈。经脱盐及冷冻干燥得到多肽冻干粉。
[0059] 使用上述方法制备的单体通过K(赖氨酸）侧链的酰胺键反应，形成下述多聚体。 具体方法为：制备多聚体时，首先采用DDE保护赖氨酸，使用Fmoc固相多肽合成法合成单体 肽，采用DDE专用托保护剂脱去赖氨酸的DDE基团，然后利用赖氨酸侧链上游离的氨基进行 第二条多肽的合成，并以此类推进行多聚体的制备；其中，所述多聚体中每个单体肽的两个 半胱氨酸形成二硫键，且单体肽个数为2-10个，XI指代Nal氨基酸，X2指代Sar氨基酸。
[0060] 采用上述方法，发明人制备了十种促红细胞生成素模拟肽衍生物，其中，所述单体 肽的个数分别为1、2、3、4、5、6、7、8、9和10 ;
[0061] 其结构式如下：
[0062] 促红细胞生成素模拟肽衍生物1，单体肽个数为1 :
[0063] GGLYACHMGPINalVCQPLRSarK
[0064] 促红细胞生成素模拟肽衍生物2,单体肽个数为2:
[0065]
[0066] 促红细胞生成素模拟肽衍生物3,单体肽个数为3:
[0067]
[0068] 促红细胞生成素模拟肽衍生物4,单体肽个数为4 :
[0069]
[0070] 促红细胞生成素模拟肽衍生物5,单体肽个数为5 :
[0071]
[0072] 促红细胞生成素模拟肽衍生物6,单体肽个数为6 :
[0073]
[0074] 促红细胞生成素模拟肽衍生物7,单体肽个数为7 :
[0075]
[0076] 促红细胞生成素模拟肽衍生物8，早体肽个数为8 :
[0077]
[0078] 促红细胞生成素模拟肽衍生物9,单体肽个数为9 :
[0079]
[0080] 促红细胞生成素模拟肽衍生物10,单体肽个数为10 :
[0081]
[0082] 实施例2.促红细朐牛成素樽拟肽衍牛物对小鼠的作用
[0083] 采用小鼠评价并比较促红细胞生成素模拟肽衍生物及促红细胞生成素蛋白对小 鼠红细胞生成的影响。
[0084] 其中，ΕΡ0药品购自沈阳三生制药有限责任公司；
[0085] 昆明种小鼠，购自中科院上海实验动物中心，体重25~30g，均为雌性小鼠，试验 中各组动物数：10只，分为12组。
[0086] 其中，10组小鼠皮注射促红细胞生成素模拟肽衍生物1-10,1组小鼠注射促红细 胞生成素蛋白，1组小鼠为空白对照，注射PBS缓冲液，剂量均为4. 5mg/kg，连续三天，然后 处死小鼠，取全血进行外周血细胞及网织红细胞计数，血细胞计数用全自动血球计数仪计 数。
[0087] 结果如表1所示，发现促红细胞生成素模拟肽衍生物及促红细胞生成素蛋白均能 明显刺激小鼠外周血网织红细胞计数的升高，说明它们刺激红细胞生成（见表1)。
[0088] 表1、促红细胞生成素模拟肽衍生物对小鼠网织红细胞生成的影响
[0089]
[0090] 实施例3 :促红细朐牛成素樽拟肽衍牛物对猕猴的作用
[0091] 采用猕猴用于评价促红细胞生成素模拟肽衍生物对红细胞生成的影响，猕猴，体 重5. 5~8. 5kg，雌雄不限，购自海南实验动物中心。猕猴根据基础血红蛋白分组，分为两 组，每组三只。一组使用衍生物3,每周静脉注射一次，每次4. 5mg/kg，一组使用ΕΡ0,三次/ 周，每次240 μ /kg，连续给药五周，每周测1次血液学指标
[0092] 结果发现，衍生物3单次静脉注射导致猕猴外周血血红蛋白含量上升（33% )，血 细胞压积升高，说明衍生物3刺激血红蛋白生成。阳性对照促红细胞生成素同样升高猕猴 外周血血红蛋白含量（34% )，升高血细胞压积，但明显不具备长效性，需要每周注射三次。
[0093] 实施例4.促红细朐牛成素樽拟肽衍牛物3对大鼠的作用
[0094] 采用大鼠评价并比较促红细胞生成素模拟肽衍生物3及促红细胞生成素蛋白对 大鼠红细胞生成的影响。
[0095] 其中，ΕΡ0药品购自沈阳三生制药有限责任公司；
[0096] SD大鼠，购自中科院上海实验动物中心，体重25~30g，均为雌性大鼠，试验中各 组动物数：10只，分为3组。
[0097] 其中，1组大鼠皮注射促红细胞生成素模拟肽衍生物3,1组大鼠注射促红细胞生 成素蛋白，1组大鼠为空白对照，注射PBS缓冲液，剂量均为4. 5mg/kg，单次给药后，连续三 天取血进行外周血细胞及网织红细胞计数，血细胞计数用全自动血球计数仪计数，并计算 衍生物3的长效性，结果发现衍生物3在单次给药后2周内依然具有刺激红细胞生成作用， 结果见表2。 [0098]
【主权项】
1. 一种促红细胞生成素模拟肤衍生物或其可药用盐，其中，所述模拟肤衍生物为SEQ ID NO: 1所示的单体肤或其多聚体； SEQ ID N0:1 :G化YACHMGPIXiVCQ化RXzK ; 其中，所述单体肤中，两个半脫氨酸（C)形成分子内二硫键，Xi表示化1氨基酸，X2表 示Sar氨基酸； 所述多聚体是由SEQ ID NO: 1中的赖氨酸（K)通过侧链游离氨基形成的多聚体 其中，所述多聚体中每个单体肤的两个半脫氨酸形成二硫键，所述多聚体中单体肤的 个数为2-10个； 优选地，所述二聚体的结构式为：所述多聚体中单体肤个数为4-10个时，结构通式如式I所示： 其中，η为4-10之间的整数；〇2. 根据权利要求1所述的促红细胞生成素模拟肤衍生物或其可药用盐，其中，所述可 药用盐为促红细胞生成素模拟肤衍生物与酸性化合物或碱性化合物反应生成的盐； 优选地，所述酸性化合物选自盐酸、氨漠酸、氨舰酸、硫酸、憐酸、对甲苯横酸、甲横酸、 草酸、对漠苯基横酸、碳酸、班巧酸、巧樣酸、苯甲酸或乙酸； 优选地，所述碱性化合物选自锭，碱金属或碱±金属的氨氧化物，W及碳酸盐、碳酸氨 盐；更优选地，所述碱性化合物选自氨氧化钢、氨氧化钟、氨氧化锭、碳酸钢或碳酸钟； 更优选地，所述促红细胞生成素模拟肤衍生物的可药用盐选自硫酸盐、焦硫酸盐、Ξ氣 乙酸盐、亚硫酸盐、亚硫酸氨盐、憐酸盐、憐酸氨盐、憐酸二氨盐、偏憐酸盐、焦憐酸盐、盐酸 盐、漠化物、舰化物、乙酸盐、丙酸盐、辛酸盐、丙締酸盐、甲酸盐、异下酸盐、己酸盐、庚酸盐、 丙烘酸盐、草酸盐、丙二酸盐、下二酸盐、辛二酸盐、富马酸盐、马来酸盐、下烘-1,4-二酸 盐、己烘-1,6-二酸盐、苯甲酸盐、氯苯甲酸盐、甲基苯甲酸盐、二硝基苯甲酸盐、径基苯甲 酸盐、甲氧基苯甲酸盐、苯乙酸盐、苯丙酸盐、苯下酸盐、巧樣酸盐、乳酸盐、丫 -径基下酸盐、 甘醇酸盐、酒石酸盐、甲横酸盐、丙横酸盐、奈-^横酸盐、奈-2-横酸盐或扁桃酸盐，优选地 为Ξ氣乙酸盐。3. 根据权利要求1或2所述的促红细胞生成素模拟肤衍生物或其可药用盐的制备方 法，所述方法包括W下步骤： 当所述促红细胞生成素模拟肤衍生物为单体肤时，根据SEQ ID NO: 1选择氨基酸，使用 Fmoc固相多肤合成法合成单体肤； 当所述促红细胞生成素模拟肤衍生物为多聚体时，根据SEQ ID NO: 1选择氨基酸，使用 Fmoc固相多肤合成法合成单体肤，然后通过单体肤赖氨酸侧链上游离的氨基偶联，将单体 肤聚合为多聚体； 任选地，将得到的单体肤或多聚体成盐。4. 根据权利要求3所述的方法，其中，所述多聚体是通过包括W下步骤的方法实现的： 首先，采用孤E保护赖氨酸，使用Fmoc固相多肤合成法合成单体肤后，采用孤E专用 脱保护剂脱去赖氨酸的孤E基团，然后利用赖氨酸侧链上游离的氨基进行第二条多肤的合 成，并W此类推合成多聚体。5. 根据权利要求3或4所述的方法，其中，所述制备方法还包括将制得的多聚体纯化， 经脱盐及冷冻干燥得到多肤冻干粉的步骤；优选地，所述纯化使用HPLC C18半制备柱进 行，流动相为乙腊。6. 如权利要求1或2所述的促红细胞生成素模拟肤衍生物或其可药用盐在制备用于治 疗W缺乏红细胞生成素为特征或W红细胞群缺少或缺陷为特征的疾病的药物中的应用； 优选地，所述W缺乏红细胞生成素为特征或W红细胞群缺少或缺陷为特征的疾病选自 末期肾功能衰竭或透析；AIDS相关性贫血，自身免疫性疾病，或恶性肿瘤；囊性纤维变性； 早期早熟性贫血；与慢性炎性疾病相关的贫血；脊髓损伤；急性失血；衰老和伴有异常红细 胞产生的肿瘤疾病。7. -种含有如权利要求1或2所述的促红细胞生成素模拟肤衍生物或其可药用盐的药 物组合物； 优选地，所述药物组合物包含一种或多种药学上可接受的辅料，所述辅料选自水溶性 填充剂、抑调节剂、稳定剂、注射用水和渗透压调节剂中的一种或多种； 优选地，所述水溶性填充剂辅料为选自W下的一种或多种：甘露醇、低分子右旋糖巧、 山梨醇、聚乙二醇、葡萄糖、乳糖和半乳糖； 所述抑调节剂选自W下的一种或多种：构祿酸、憐酸、乳酸、酒石酸、盐酸等非挥发性 的酸，W及氨氧化钟、氨氧化钢或氨氧化锭、碳酸钢、碳酸钟、碳酸锭盐、碳酸氨钢、碳酸氨钟 和碳酸氨锭盐； 所述稳定剂选自W下的一种或多种：邸TA-2化、硫代硫酸钢、焦亚硫酸钢、亚硫酸钢、憐 酸氨二钟、碳酸氨钢、碳酸钢、精氨酸、谷氨酸、聚乙二醇6000、聚乙二醇4000、十二烷基硫 酸钢和Ξ径甲基氨基甲烧；优选地选自W下的一种或多种：焦亚硫酸钢、憐酸氨二钟、精氨 酸、聚乙二醇6000和Ξ径甲基氨基甲烧； 所述渗透压调节剂为氯化钢和/或氯化钟。
【文档编号】C07K1/06GK105837681SQ201510015563
【公开日】2016年8月10日
【申请日】2015年1月13日
【发明人】龚珉, 郑学敏, 于冰, 孔维苓, 黄长江, 吴疆, 徐为人
【申请人】天津药物研究院