专利名称：制备用作血液学对照品的红细胞组分的制作方法
制备用作血液学对照品的红细胞组分本申请是国际申请号为PCT/US 2007/073625，国际申请日为2007年7月16日，进入中国国家阶段的申请号为200780027^2. 5，名称为“制备用作血液学对照品的红细胞组分”的发明专利申请的分案申请。早期申请的交叉引用本申请要求2006年7月17日提交的美国临时专利申请号60/807，585的优先权， 其内容通过引用全文纳入本文。
背景技术：
1.发明领域本发明涉及血液学仪器的对照品材料领域，特别是关注对照品材料的红细胞组分。2.现有技术描述分析血液组分和化学性质的血液学仪器已使用多年，在此期间这些仪器的精确性和灵敏度不断提高。因此，早期形式的血液学仪器已被能根据各组分复杂而微妙的特征来分析血液中不连续组分的较复杂机器替代。除了检测红细胞和血小板外，自动血液学仪器中的最新发展是人白细胞的多组分分析。白细胞群通常包括淋巴细胞、单核细胞、嗜中性白细胞、嗜碱性粒细胞和嗜酸性粒细胞。血细胞分析方法包括检测各类血细胞的电学和光学特性。典型的仪器可单独对白细胞组分计数和区分红细胞和血细胞大小。为计数白细胞，需要利用洗涤剂，例如季铵盐破坏红细胞，从而留下白细胞计数和区分大小。Beckman-Coulter 五组分白细胞分析仪器采用几种不同的技术，各依据电阻率、 电导率(采用低压DC检测的DC数字操作)、Rf (射频)调制和激光技术(包括光散射和光吸收)。通常联用Rf检测和DC低频检测以产生称为不透明度的参数，其是Rf除以DC的计算值。其它生产商，例如 Abbott Diagnostics 、Bayer 和 TOA Medical Electronics 的仪器联用电阻率，DC电导率和/或激光技术、Rf、去极化的90°角光散射和/或光吸收。 虽然电子技术的基础类型看似相同，但各生产商对于分析血细胞所需的仪器硬件和软件具有独特的实现方式。各生产商对于该技术的各自实现方式导致各生产商的各自具体仪器需要大量不同的试剂和方法，从而增加了它们应用复杂性和花费。现有的试剂或方法无一可用于多种仪器。为确保血液学仪器的可靠性和精确性，管理当局要求利用血液对照品以验证仪器的完整性。最佳对照品含有代表新鲜血液的所有细胞元件的颗粒，以及合成血浆，这是一种人工配制的液体悬浮介质以模拟人血浆。合成血浆通常含有与天然血浆的组分相同的或以相同方式起作用的组分。这些组分包括无机盐、有机和/或无机缓冲液及维持与血浆蛋白质所维持相类似的稳态的粘性材料。对照品的生产商提供，例如细胞计数、细胞大小和细胞类型等所有关键值。对照品材料应具有足够的保存期，从而能使用数天、数周或数月，进而确保仪器性能随时间推移而一致。制备血液学对照品的方法依赖于使用该对照品的具体仪器的硬件和软件设计以及长期保存的要求。血液对照品由RBC组分构成，通常是将经洗涤的人红细胞悬浮在合成血浆中。红细胞伴有会被仪器视作白细胞亚群的一种或多种颗粒。虽然白细胞对照品可以是人白细胞，但可使用以交联剂稳定从而能防止被洗涤剂破坏的动物红细胞作为替代。可用作Coulter -型仪器的人白细胞、红细胞或血小板对照品的血液对照品产物中的颗粒对于其它仪器，例如Abbott Laboratories 、Bayer 或TOA Medical Electronics生产的那些仪器可能无效。此外，因为这些颗粒通常是修饰形式的各种类型血细胞，它们的性能与活的天然新鲜血细胞不相似。例如，对于Abbott 仪器，用交联剂，如戊二醛固定的人白细胞的性能类似于嗜中性粒细胞，而对于Coulter 仪器类似于细胞碎片。对于某一类血液学仪器，特别处理并交联的非哺乳动物脊椎动物的红细胞还可显示为单核的细胞，而对于另一类仪器可显示为淋巴细胞。血液学对照品的红细胞组分可在许多仪器上良好使用以验证数值和化学值，例如计数和血红蛋白含量以及物理特征，例如大小和形状，而这些数值，特别是物理特征的那些值，例如平均细胞容积(MCV)、大小分布(RDW，即红细胞分布宽度)和细胞形状在不同仪器之间差别很大。此外，一类仪器可将红细胞制品读取为在血小板和/或白细胞计数区中所含的碎片，而另一类仪器读取为不含这种碎片。例如，生物辐射实验室公司(Bio-Rad Laboratories, Inc.)制造的血液学(C)产品中的红细胞制品在拜尔Hl-E血液学仪器(Bayer Hl-E Hematology Instrument)上具有高血小板背景。在阿伯特细胞-DYN 4000 (Abbott CELL-DYN 4000)仪器上，此同一红细胞制品在光学血小板和白细胞区中显示有干扰。在阿伯特细胞-DYN3000系列或1000系列仪器上不出现血小板或白细胞干扰。生物辐射血液学(C)产品所用的红细胞制品在考特尔(Coulter)仪器，例如考尔特MaxM型 (Coulter Model MaxM)上显示没有血小板或白细胞干扰，但在阿伯特细胞-DYN 4000仪器上确实显示血小板和白细胞干扰。现有技术报道了将某些分析物加入血液对照品的悬浮介质，从而通过改进组分的物理特征和防止颗粒碎片形成来改善该对照品中红细胞组分性能。Ryan等在美国专利号 6，403，377B1中指导可加入脂蛋白来改善白细胞组分的大小特征，加入抗氧化剂以防红细胞裂解。^ung在公布的美国专利申请号US2005/0221497A1中类似地公开了利用脂蛋白增加白细胞组分的容积。与Ryan等相反，在^img的申请中，脂蛋白通过考特尔仪器所用的洗涤剂起到使红细胞适当裂解的作用。Young还描述了血液对照品中需要非离子洗涤剂以进一步促进红细胞裂解，而不损害血液对照品中所用白细胞替代品的完整性。已证明固定红细胞是提供适用作白细胞类似物的不可裂解颗粒的有效方法。Hunt 在美国专利号3，873，467中描述了利用人红细胞产生白细胞类似物的固定方法。上文Ryan 等描述了利用交联剂稳定红细胞。借助这些方法固定的细胞可耐受机械应力，例如超声处理诱导的应力。上文^ung等详细描述了产生许多不同类型白细胞类似物的固定方法。 Carver 等在美国专利号 6，146，901，6，514，763B2，4, 704，364和 5，380，664 中公开了白细胞类似物的其它固定方法。本章节和本说明书它处引用的所有专利和公布的专利申请通过引用纳入本文。发明概述本发明的目的之一是提供从脊椎动物来源制备用于血液学血液对照品中的红细胞的方法，特别是足够灵活从而能补偿血液学仪器生产商所用不同技术的方法。本发明使得人们可采用本文所述方法定制工艺，从而获得唯一符合所选血液学仪器规格的血液学对照品。提供从人红细胞制备血液学血液对照品而无需血浆胆固醇或脂蛋白来增强红细胞可裂解性的方法也是本发明目的之一。本发明的另一目的是提供含有红细胞组分的血液学血液对照品，其中所述对照品本身不需要表面活性剂或其它裂解促进剂来增强红细胞组分在血液学仪器中的可裂解性能。本发明的另一目的是提供含有红细胞组分的血液学血液对照品，其中所述红细胞组分用交联剂固定从而尽可能降低或防止形成干扰血小板和白细胞计数区的颗粒。本发明的另一目的是提供含有红细胞组分的血液学血液对照品，其中所述红细胞组分(a)用交联剂固定从而能为多种仪器类型提供均勻的大小和形状和(b)在有已知常规血液学仪器所用的和本领域用于区分白细胞亚群的温和洗涤剂存在下，仍维持可裂解性能。本发明的另一目的是提供能在不同生产商制造的多种仪器上使用的血液学血液对照品。本发明还有另一目的是提供易制备且廉价的血液学血液对照品。为实现这些和其它目的，通过用低浓度固定剂在较短时间内处理(S卩，预处理)脊椎动物来源的红细胞，即，哺乳动物无核红细胞而获得用于实施本发明的红细胞组分。固定剂可以是已知用作组织稳定剂的各种物质之一，预处理方法包括将细胞与固定剂温育足够长的时间以交联细胞，从而将可裂解细胞留在仪器中。一旦经预处理，将细胞与代表其它血细胞类型的组分混合而完成对照品的组成，然后在仪器中以与待分析血液样品相同的方式加工该对照品。然后将分析结果与对照品的已知组成，即已知的血细胞分布作比较，比较结果用于核查仪器的状况以验证该仪器是否处于可用于实际样品的状况。预处理方法是有限的固定方法，不同于现有技术中典型的血液对照品的红细胞固定方法，该方法使得细胞耐受血液学仪器所用洗涤剂的裂解作用。在本发明中，固定红细胞的方式使得固定的细胞可在规定的仪器验证条件下裂解，从而能视需要计数对照品中的红细胞和白细胞以及任何其它血液组分。此种固定仍足以提供具有计数稳定性、物理稳定性(即，稳定的容积和形状) 和颗粒完整性的红细胞，从而防止形成可干扰白细胞和/或血小板分析的颗粒。该方法还获得在多种仪器技术中均能一致记录细胞大小和计数的红细胞，所述技术包括但不限于电学(例如，电阻率)和光学(例如，光散射)技术。发明和优选实施方式详述可用于实施本发明的固定剂的分子结构极为不同。一组这样的固定剂是有机二醛，优选含有由连接基团隔开的两个末端醛基的那些固定剂，所述连接基团包含含有至少两个碳原子的主链。此主链还可含有杂原子，例如0原子和N原子，但特别优选的主链是2-6 个碳原子的饱和亚烷基(即，二价烷基链)。连接基团还可含有与主链键合作为侧链的支链基团，例如-OH、-NH2, -CH2, -OCH3和这些基团的同系物及类似物，但特别优选的连接基团是不含侧链的直链亚烷基。符合后一描述的有机二醛的例子是戊二醛和丁-1，4-二醛。丁-1， 4- 二醛的来源之一是HISTOCHOICE ，美国俄亥俄州梭仑市安莱斯科公司(Amresco Inc.，Solon, Ohio, USA)的一种市售可得的组织固定剂，由其供应商鉴定，Camiener在 1995年7月4日授权的美国专利号5，429，797中公开。根据产品资料，除丁 _1，4_ 二醛外，HIST0CH0ICE的组分是乙二醛、氯化钠和硫酸锌。可用于实施本发明的另一组固定剂是二偶氮烷基脲、咪唑烷基脲、二羟甲基脲、二羟甲基-5，5-二甲基乙内酰脲、2-溴-2-硝基丙-1，3-二醇、季金刚石(quaternary adamantine)、4_羟甲基氮杂_3，7_ 二氧杂双环 [3.3.0]辛烷和5-羟甲基-1-氮杂-3，7-二氧杂双环[3.3.0]辛烷。该组中，优选二偶氮烷基脲和咪唑烷基脲。二偶氮烷基脲可购自美国内布拉斯加州拉维斯塔市斯特莱科实验室公司(Streck Laboratories, Inc.，La Vista, Nebraska, USA)的斯特莱科组织固定剂 (Streck Tissue Fixative)，其中二偶氮烷基脲是主要活性成分，而2_溴_2_硝基丙_1， 3- 二醇、硫酸锌和少量甲醛作为其它成分。尽管与现有技术相比，此种预处理RBC的条件通常是温和的，但可在一定范围内调节。当在室温下或通常在约15°C-约25°C (59° F-77° F)的温度范围内作预处理，例如，固定剂浓度可以为约0. -约1.0% (重量/体积比，即克/mLX 100)，温育时间可以是约0. 5小时-约4小时。相反，当在降低的温度下，例如约2V -约8°C (36° F_44° F) 作预处理，固定剂浓度可以为约0. 05% -约0. 25% (重量/体积比)，温育时间可以是约 16小时-约48小时。可以在一阶段或多阶段中进行固定剂处理。第一阶段可以，例如包括在室温或 15-25°C的中等温度(15°C -25°C )以极低的固定剂浓度(例如0. 001 % -0. 25 % )短期 (0. 5小时-4小时)处理；而第二阶段可包括处理的接触时间和温度相同但浓度较高，例如 0. 1% -1. 0%，或在降低的温度-8°C )处理较长时间(16小时-48小时)。本领域技术人员明白其它加工方法。固定剂接触后，可以通过，例如在约2°C -约8°C，没有固定剂存在下在模拟血浆中温育约7天-约30天来实现细胞的条件化，诸次处理之间可用常规洗涤溶液进行洗涤步骤和用常规血浆替代品进行稳定步骤。可用于实施本发明的红细胞通常是哺乳动物无核红细胞，例如人、牛、绵羊、山羊和非禽类家畜的红细胞。优选人红细胞。此外，在实施本发明中可预处理各种红细胞。包括A型、Bl型和B2型。如上所述，对照品的其余组分可以是血液学对照品的常规组分，包括白细胞组分和血小板组分。白细胞组分可以是固定的脊椎动物红细胞或非生物学颗粒，例如聚苯乙烯、 聚乙烯甲苯或苯乙烯二乙烯基苯微珠。还可使用生物来源的微粒；例子有乳胶颗粒和植物花粉。Carver等的美国专利申请公布号US2002/0022269AK2002年2月21日公布)及其引用的参考文献公开了其它材料。血小板组分可以是获自山羊的缩小至人血液血小板大小的红细胞，可将山羊红细胞悬浮在盐浓度连续增加的一系列水性高渗盐溶液中直至获得所需大小。合适的盐溶液的例子是萘酚二磺酸二碱金属盐，例如2-萘酚-6，8-二磺酸二钾盐和2-萘酚-3，6- 二磺酸二钠盐的溶液。本领域已知获得血小板组分的其它盐溶液和其它方法，这些溶液和方法也可用于本发明。用作对照品的悬浮介质的人工或模拟血浆可以是用于该目的的各种已知液体制品。合适的制品对于哺乳动物血液是等渗的，含有与天然血浆相同或相似的组分或具有与天然血浆相同或相似的功能。这些组分包括无机盐、有机和无机缓冲液及维持稳态的粘性材料，例如哺乳动物白蛋白或合成的替代品，如聚乙二醇。通常还包含一种或多种抗生素，例如ftx)Clin P150、阿米卡星、庆大霉素、青霉素和四环素。可由商业供应商提供的合成血浆的例子是美国特拉华州威尔明顿市杜邦医药公司(DuPont Pharmaceuticals,Wilmington, Delaware, USA)的HESPAN 、杜邦医药公司的PENTASPAN 、美国新泽西州皮斯卡塔韦市法玛西亚公司(Pharmacia，Inc.，Piscataway, New Jersey, USA)的 MACRODEX 、法玛西亚公司的RHEOMACRODEX 和美国加利福尼亚州伯克利市
生物时代公司(BioTime，Inc.，Berkeley, California, USA)的HEXTEND 。模拟血浆通常是生理浓度的电解质水溶液加上大分子膨胀剂(macromolecular oncotic agent)和生物学缓冲液。除了用作血液学对照品的悬浮介质外，人工血浆还可用作在条件化后稳定细胞的悬浮介质。在一些情形中，根据考虑的具体血液学仪器选择具体的人工血浆，因为人工血浆可能影响仪器制造技术的特定白细胞和血小板计数区中的颗粒存在。如上所述，本领域已知不同生产商的血液学仪器采用不同的血细胞计数技术。因此，血液样品中存在的部分降解的红细胞或红细胞片段可出现(并被计数)在一些仪器的白细胞读出区、血小板区或二者中，虽然在其它仪器中，这些部分降解的细胞和片段不出现在这些区域中。此外，正常或异常的新鲜红细胞或储存红细胞的电阻率和/或光学特性可以是完整的红细胞或降解的细胞(例如，红细胞影和/或片段)可因仪器设计而表现不同。例如，利用阿伯特细胞-Dyne CD4000时，异常的新鲜红细胞可存在于WBC计数区，因为该红细胞耐受裂解剂。利用考特尔仪器，相同的异常红细胞不会显示或可能具有不同的特征(signature)(颗粒分布)。对于本发明，可依据使用对照品的仪器是要显示完整红细胞的电学或光学特性的任何改变还是要显示部分降解的细胞或细胞片段(例如红细胞以外的血液组分)的电学或光学特性的任何改变，从而在不同条件下修饰红细胞以作为对照品。因此，可以调节固定剂的接触时间、温度和浓度以实现所需的修饰程度从而避免在仪器读出中错误表示细胞类型的分布，但仍能按照仪器的方案裂解红细胞组分。有技术和有经验的血液学家不难知道各种仪器的有关操作和差异的信息，这些信息有时由生产商提供， 不难据此选择最佳条件。通过常规研究，用在柠檬酸盐水中洗涤并悬浮在人工血浆中的标准红细胞悬液运行仪器，观察读出结果以标出任何电学或光学修饰的完整细胞或部分降解的细胞及片段出现之处也不难确定这种信息。作为本发明示例，典型的红细胞制备过程所需的组分如下所示通常在献血点收集的包装人红细胞洗涤包装人红细胞的液体初步固定经洗涤的包装人红细胞的液体洗涤初步固定的细胞的液体悬浮经洗涤的初步固定细胞的液体任选的用于次级固定经洗涤的初步固定细胞的液体，和用于洗涤次级固定细胞的液体用于保存初步(或次级)洗涤的固定细胞的液体提供以下实施例只是出于说明目的，其中所有百分比依据重量/体积。
实施例以下实施例说明了用于商业血液对照品的A型红细胞组分的制备，该产品在多种血液学技术平台上均能提供均勻一致的红细胞值。本实施例所用的方法获得的对照品不会在非RBC区(即，白细胞和血小板分析区)中因散射颗粒而产生干扰。本实施例采用拜尔(以前的泰克尼康公司(TechniconDHl-E仪器的示例性分布为用于拜尔5-组分仪器作了优化。该方法防止在下部血小板计数区中形成颗粒物，但在仪器类型之间仍能提供具有一致RBC参数的血液对照品的红细胞组分。这对于拜尔仪器是重要的特征，因为这些仪器采用独特的方法来评估RBC容积、分布宽度和细胞血红蛋白含量。该方法如下所示1.将献血点包装的RBC加入IL离心瓶，加入等渗的平衡柠檬酸洗涤溶液至(红细胞)计数为 2 X IO6/μ L-4 X IO6/μ L，优选 3 X IO6/μ L。2.以2，000-4, 000RPM，优选3，000RPM离心10-30分钟，优选20分钟，吸弃上清液，
注入柠檬酸洗涤溶液至(红细胞)计数为2 X IO6/μ L-4 X IO6/μ L，优选3 X IO6/μ L。3.重复柠檬酸洗涤步骤，用柠檬酸洗涤溶液重悬至(红细胞)计数为2Χ IO6/ μ L-4 X IO6/μ L，优选 3 X IO6/μ L。4.将重悬的RBC倾倒入含有足够戊二醛的第二个IL瓶中，至浓度等于戊二醛储备液的1%。5.室温下固定0. 5-4小时，优选2小时。6.如上所述用柠檬酸洗涤溶液洗涤。7.在人工血浆中重悬12-20小时，优选16小时。8.以2，000-4, 000RPM，优选3，000RPM离心10-30分钟，优选20分钟，吸弃上清液， 注入人工血浆溶液至红细胞计数为2 X IO6/ μ L-5 X IO6/ μ L，优选2 X IO6/ μ L。 9. 2-8°C，以 1 X IO6/ μ L_3 X IO6/ μ L，优选 2 X IO6/ μ L 保存 7-30 天，优选 21 天使细胞条件化。10.吸弃上清液至最终血液对照品所需的RBC计数，其范围依据目标值为约 0. 5-7 X IO6/ μ L0例如，1级可以是0. 5-4X IO6/ μ L，2级可以是2-5 X IO6/ μ L，3级可以是 3-7 X IO6/μ Lo11.加入固定的脊椎动物白细胞形式的白细胞组分(WBC)，固定的脊椎动物RBC形式和/或其它颗粒形式(如乳胶颗粒和花粉)的WBC类似物。12.加入血小板组分，例如用抗凝剂制备的天然哺乳动物血小板或从动物来源制备的血小板类似物。优选的血小板组分是动物来源的，例如Hunt在美国专利号US 4，179，398中公开的山羊红细胞。13.按照生产具有正常和异常血液学状态的血液对照品所需调节细胞计数和细胞大小。为进行比较，将戊二醛用作组织固定的固定剂的现有技术条件包括使组织与浓度约为的戊二醛接触约M小时。将上述方法产生的对照品用于拜尔Hl-E和阿达维 (Advia) 120仪器，不会在下部血小板区形成颗粒。该对照品在阿伯特⑶4000上的光学血小板区产生月牙形颗粒分布，在⑶4000WBC散射图中产生碎片。这在⑶4000中看导致WBC(白细胞)和RBC (红细胞)系统误差。用6种商业血液学仪器检验本实施例所用对照品的红细胞计数(RBC)、血红蛋白 (HGB)和平均细胞容积(MCV)，还用相同的6种仪器检验新鲜血液样品。新鲜血液的结果示于表I，对照品的结果示于表II。表 I
权利要求
1.一种血液对照品，其包含相对量已知的悬浮在模拟血浆中的红细胞组分、白细胞组分和血小板组分，所述红细胞组分由Bl型哺乳动物无核红细胞构成，而该哺乳动物无核红细胞已通过在2°C-8°C的温度下用0.05%-2. 5% (重量/体积)固定剂浓度的丁 _1，4-二醛温育16小时-48小时作了预处理从而交联所述红细胞同时将可裂解的所述红细胞留在血液学仪器中。
2.如权利要求1所述的血液对照品，其特征在于，与所述固定剂进行所述温育后，所述哺乳动物无核红细胞在没有固定剂存在下，在2°C _8°C通过在模拟血浆中温育7天-30天作进一步预处理。
3.一种血液对照品，其包含相对量已知的悬浮在模拟血浆中的红细胞组分、白细胞组分和血小板组分，所述红细胞组分由B2型哺乳动物无核红细胞构成，而该哺乳动物无核红细胞已通过在15°C _25°C的温度下用0. 001% -0. 25% (重量/体积)浓度的戊二醛温育 0. 5小时-4小时，然后在2V -8°C的温度下用0. 05% -2. 5% (重量/体积)浓度的丁 -1， 4- 二醛温育16小时-48小时作了预处理从而交联所述红细胞同时将可裂解的所述红细胞留在血液学仪器中。
4.如权利要求3所述的血液对照品，其特征在于，所述血液对照品不含裂解促进剂。
5.如权利要求3所述的血液对照品，其特征在于，与所述固定剂进行所述温育后，所述哺乳动物无核红细胞在没有固定剂存在下，在2°C _8°C通过在模拟血浆中温育7天-30天作进一步预处理。
全文摘要
处理脊椎动物的红细胞使之成为血液学对照品的有效组分，该对照品可用于检测所有血细胞组分，包括白细胞和血小板。该处理包括在浓度和接触时间有限的条件下利用固定剂，得到的红细胞稳定但可在血液学仪器中裂解且形成颗粒的倾向性降低。
文档编号G01N33/96GK102213725SQ20111011806
公开日2011年10月12日 申请日期2007年7月16日 优先权日2006年7月17日
发明者F·J·卡弗, L·格拉尼耶 申请人:生物辐射实验室股份有限公司