红细胞膜包裹的酸敏感高分子前药纳米递药系统的制备方法及用图
【技术领域】
[0001] 本发明设及高分子化学和纳米制剂技术领域，具体地说是一种用于抗肿瘤药物递 送的长循环酸敏感高分子递药系统的制备及用途。
【背景技术】
[0002] 化疗是最常见的恶性肿瘤治疗手段之一，但是统计表明，目前临床上化疗并未导 致癌症患者死亡率的实质性降低。紫杉醇是最有效的化疗药物之一，主要用于治疗肺癌、卵 巢癌和乳腺癌等。紫杉醇具有聚合和稳定细胞内微管的作用，致使快速分裂的肿瘤细胞在 有丝分裂阶段被牢牢固定，使微管不再分开，可阻断细胞于细胞周期之G2与M期，使癌细胞 复制受阻断而死亡。紫杉醇的低水溶性(0.003mg/ml)大大的限制了它在临床上的应用。目 前被批准临床上使用的紫杉醇制剂有:Taxol愈，由聚氧乙締藍麻油和乙醇（1:1，v/v)形成的 制剂，但聚氧乙締藍麻油会导致严重的副作用，如过敏反应。二代紫杉醇制剂包括 Abraxan泌:，和Gcnexol-PM嚴，与Taxol'K相比，二代制剂降低了毒副作用，提高了耐受剂量， 显示出了良好的药代动力学特性。但是释药和体内循环时间较短问题仍然存在，运也是导 致紫杉醇二代制剂不理想的原因。
[0003] 在肿瘤组织中适时、足量释药是一个祀向纳米递药系统发挥效应的关键一步。为 达到运一目的，肿瘤微环境响应型递药系统在近年来得到很大进步，主要包括抑敏感、溫度 敏感、酶敏感型递药系统，运些递药系统可改善药物释放行为，提高药效。目前紫杉醇聚合 物前药已有大量文献报道，包括?66斗1乂，？64斗1乂，？664斗1乂。虽然与游离紫杉醇相比运些 前药显示出更高的溶解性和肿瘤祀向性，但是仍存在释药不充分的问题。如PGG-PTX 60小 时体外释药仅为10%。为改善运一问题，利用肿瘤组织(pH 6-6.5)及肿瘤细胞内涵体与溶 酶体中（ <抑5)的低抑值的特征，合成了一种pH敏感的高分子水溶性紫杉醇前药PGSC-PTX， 显示出良好的抑敏感性【CN 201510051159.0】。
[0004] 长循环纳米递药系统由于可W延长药物全身传递时间并更好实现肿瘤的祀向效 果而备受关注。目前最常见的方法是用高亲水性物质聚乙二醇(PEG)对纳米粒子进行表面 修饰，且已有PEG化的纳米递药系统上市。但是，有研究发现机体会对PEG化纳米载体产生抗 PEG免疫反应，从而激发其被网状内皮细胞吞隧。由于红细胞在体内良好的循环特性，有研 究者依据红细胞膜的结构特点，对纳米粒子表面进行模拟红细胞膜的修饰来达到延长体内 循环时间的目的，但是运种方法需要进行红细胞膜蛋白鉴别、纯化与化学连接等工作，无疑 增大了纳米粒的制备难度，且难W使纳米载体完全模拟红细胞膜结构特点。张良方副教授 提出利用红细胞膜直接包裹纳米粒，在保留纳米粒功能的同时，赋予纳米粒长循环的特性。 研究表明，与PEG化纳米粒相比，红细胞膜包裹纳米粒的半衰期延长了2.5倍。此外，由于红 细胞膜的易获得性、内源性、低免疫原性等优点，可W大大增加递药系统的成药性。因此，红 细胞膜包裹技术为增加纳米递药系统的体内循环时间、提高药物成药性和有效性提供了一 种简单实用的方法。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于针对递药系统在体内的长循环、释药问题，提供一种红细胞膜 包裹的载紫杉醇的酸敏感纳米递药系统RBCm/PGSC-Pl'X用于肿瘤治疗药物的制备。将该递 药系统静脉注射入血后，红细胞膜的包裹可保证该递药系统在血液中长循环;在肿瘤酸性 环境中，PGSC-Pl'X可加速降解并释放足量的PTX，杀死肿瘤细胞。该递药系统的成功实施将 为当前肿瘤治疗提供一种合理化方式。
[0006] 实现本发明目的的具体技术方案是：
[0007] -种红细胞膜包裹的酸敏感高分子前药纳米递药系统的制备方法，该纳米递药系 统由红细胞膜包裹酸敏感高分子前药纳米粒构成，其酸敏感高分子前药为PGSC-PTX，由聚 谷氨酸钢和簇甲半脫氨酸通过肤键连接组成，再与抗癌药物紫杉醇PTX键合形成，其结构如 下：
[0009] 能自组装形成平均粒径为50nm的纳米粒，并可在酸性环境下释放药物PTX;
[0010] 特点在于，所述纳米递药系统的制备方法包括：
[OOW 步骤1:制备红细胞囊泡：取小鼠全血，离屯、操作，破膜释放内含物，得到空红细胞 膜，超声得到均一的红细胞膜囊泡；
[001 ^ 步骤2:红细胞膜囊泡与酸敏感高分子前药比例为50-70亿个:6-lOmg，将酸敏感高 分子前药与红细胞膜囊泡混合，在IOOW，59Hz条件下超声5min;得到粒径均一的红细胞膜包 裹的酸敏感高分子前药纳米粒即所述纳米递药系统RBCm/PGSC-PTX，通过G50葡聚糖凝胶柱 分离纯化；
[0013] 步骤3:测定所述纳米递药系统的粒径、形态；
[0014] 步骤4:测定所述纳米递药系统的长期稳定性；
[0015] 步骤5:测定所述纳米递药系统的血清稳定性；
[0016] 步骤6:测定所述纳米递药系统的体外药物释放特征；
[0017] 步骤7:测定所述纳米递药系统对肺癌细胞的摄取；
[001引步骤8:巧憶所述纳米递药系统对肺癌细胞的毒性；
[0019] 步骤9:测定巨隧细胞对所述纳米递药系统的摄取；
[0020] 步骤10:测定所述纳米递药系统对红细胞膜的破坏作用；
[0021 ]步骤11:测定所述纳米递药系统在大鼠体内的循环时间；
[0022] 步骤12:测定所述纳米递药系统对肺癌肿瘤生长的抑制作用。
[0023] 所述步骤2采用超声方法包裹酸敏感高分子前药，用G50葡聚糖凝胶柱分离纯化纳 米递药系统。
[0024] 本发明制备的红细胞膜包裹的酸敏感高分子前药纳米递药系统的用途，其特征在 于，该纳米递药系统用于制备能够进行长循环、被动祀向、运送活性物质的抗肿瘤药物。
[0025] 本发明的递药系统具有W下特征:粒径在IOOnm左右，呈球形；在憐酸缓冲液和血 清中均比较稳定;在酸性环境下药物释放特性较好;在细胞实验中毒性明显降低；巨隧细胞 对该系统的摄取明显减少;该系统对红细胞没有破坏作用，可用于静脉注射;该系统在血液 中的循环时间明显比高分子长;该系统对肺癌肿瘤生长有明显抑制作用。
【附图说明】
[00%] 图1为本发明RBCm/PGSC-PTX制备流程图；
[0027] 图2为本发明RBCm/PGSC-PTX NPs的粒径图和透射电镜图；
[00%]图3为本发明RBCm/PGSC-PTX NPs的长期稳定性实验和血清稳定性实验图；
[00巧]图4为本发明RBCm/PGSC-PTX NPs在不同抑下药物释放对比图；
[0030] 图5为本发明RBCm/PGSC-PTX NPs的体外细胞摄取实验图；
[0031] 图6为本发明RBCm/PGSC-PTX NPs的体外细胞毒性实验图；
[0032] 图7为本发明RBCm/PGSC-PTX NPs的免疫原性试验图；
[0033] 图8为本发明RBCm/PGSC-PTX NPs的溶血性试验图；
[0034] 图9为本发明RBCm/PGSC-PTX NPs的长循环试验图；
[0035] 图10为本发明RBCm/PGSC-PTX NPs的疗效试验图。
【具体实施方式】
[0036] 高分子前药紫杉醇载药量为32.8%。
[0037] 实施例1
[0038] (1)红细胞膜囊泡的制备
[0039] 1)取20g左右重量的小鼠，腹腔注射0.2ml的2 %戊己比妥钢溶液，待完全麻醉后， 剖开剑突及W上部位，暴露屯、脏后，从左屯、室进针，取用肝素钢润洗过的注射器取血(大约 Iml)，取血后转移至2ml含肝素钢的EP管中；
[0040] 2)将全血放入离屯、机中离屯、，900g，20min，弃去上层清液，留下暗红色沉淀，取沉 淀3倍体积的1冲BS放入，并均匀吹散，放入离屯、机离屯、2500g，15min.此为第一次洗涂，重复 操作立次；
[0041] 3)上述最后一次操作后，弃去上层清液，留下沉淀，取沉淀等量的1*PBS放入离屯、 管中吹散，取950ul的0.2mM的抓TA放入离屯、管混匀，待充分溶血后，加入50ul20冲BS，于 21000g，离屯、7min.此为第一次溶血洗涂重复操作五次；
[0042] 4)上述最后一次操作后，弃去上层清液，加入1mlO.2mM的抓TA重悬，即为红细胞膜 悬浮液。
[0043] 5)将得到的红细胞膜悬液在IOOW，59Hz条件下超声5min，得到均匀的红细胞膜囊 泡。
[0044] (2)红细胞膜包裹酸敏感的高分子前药纳米系统的制备
[0045] 1)配制浓度为8mg/ml的高分子前药纳米粒；
[0046] 2)将配置好的上述高分子前药纳米粒与Iml全血中提取的红细胞囊泡混合，在 100W，59化条件下超声5min，得到红细胞膜包裹酸敏感的高分子前药纳米系统；
[0047] 3)用G50葡聚糖凝胶柱分离纯化上述纳米系统，得到粒径均一的红细胞膜包裹高 分子前药纳米系统。
[004引实施例2
[0049]配置高分子载紫杉醇前药（PGSC-PTX)和红细胞包裹的高分子载紫杉醇前药 (RBCm/PGSC-PTX) Img/ml，超声5分钟后静置2分钟，用马尔文激光粒度仪测定其粒径大小和 粒径分布，图2(A、B)显示纳米颗粒径分布情况，PGSC-PTX和RBCm/PGSC-PTX两种纳米粒的平 均粒径分别为50nm和IOOnm左右。
[00加]实施例3
[0051 ] PGSC-PTX和RBCm/PGSC-PTX的形态通过透射电子显微镜（TEM)来观察，需用1 %的 憐鹤酸负染制备样品，具体如下：（1)滴一滴样品溶液于铜网上，（2)空气中干燥约10分钟， 用滤纸吸去多余的液体，（3)再滴一滴1%的憐鹤酸于铜网上，室溫干燥5分钟后用滤纸吸去 多余的染液，（4)待样品干燥后置于透射电镜下观察。图2(C、D)为PGSC-PTX和RBCm/PGSC-PTX两种纳米粒的透射电镜图片，两种纳米粒形态均比较规则，呈球形。
[0化2] 实施例4
[0053] 将PGSC-PTX和RBCm/PGSC-PTX用PBS液配制成1 .Omg/ml，用动态光散射仪(DLS)测 定粒径大小和分散性指数(PDI)，每两天测定一次，连续测定两周，考察纳米粒子的长期稳 定性。结果如图3(A)，两种纳米粒的稳定性良好，放置半个月后粒径无明显变化(p〉0.05)。 [0054] 实施例5
[0055]将PGSC-PTX和RBCm/PGSC-PTX用 100%FBS配制成 1. Omg/ml，样品置于37°C轻轻震 荡，分别于不同时间点取样在560nm条件下测定吸光值，每组重复测定S次，根据吸光值来 考察样品的血清稳定性。两种纳米粒的血清稳定性如图3(B)，在放置4小时后PGSC-PTX和 RBCm/PGSC