制备成熟胰岛素多肽的方法
【专利说明】制备成熟胰岛素多肽的方法 技术背景
[0001] 本发明涉及制备成熟胰岛素多肽的重组蛋白表达和蛋白化学。
[0002] 背景 胰岛素是在胰岛β细胞中产生的多肽激素。有活性的胰岛素分子是由通过两个二硫 键相连的Β-链和Α-链组成的双链分子。胰岛素以结构为B-C-A的前体分子胰岛素原形式 合成，其中C-肽链将Β-链的C-末端氨基酸残基与Α-链的Ν-末端氨基酸残基相连。成熟 的双链胰岛素通过在位于与Α-链和Β-链的接点处的碱性氨基酸残基对处体内切割C-肽 而形成。Α-链和Β-链通过分别位于Α7和Β7以及Α20和Β19Cys残基之间的两个二硫键 保持在一起。此外，生物学活性的胰岛素分子在A6和All位Cys残基之间有一个内部二硫 键。
[0003] 已经描述了在基因修饰宿主细胞例如大肠杆菌和酵母中生产胰岛素及其前体的 许多方法。在大多数酵母工艺中，具有或天然C-肽或修饰的C-肽的胰岛素前体被表达和 从酵母细胞中分泌出来。W090/10075公开了具有C-肽AAK的胰岛素前体。W001/49742公 开了具有包含芳族氨基酸残基的C-肽的胰岛素前体。W002/079251公开了具有包含Gly残 基的C-肽的胰岛素前体。W002/079250公开了具有包含Pro残基的C-肽的胰岛素前体。 TO02/100887公开了具有包含糖基化位点的C-肽的胰岛素前体。W02008/037735公开了 具有包含kex2p切割位点的C-肽的胰岛素前体。W02011/099028公开了降低在毕赤酵母 (/VcAia6·/?)中产生的胰岛素或胰岛素类似物前体分子的0-糖基化水平的方法。
[0004] 如果没有直接获得成熟胰岛素或胰岛素类似物产物，则在一个或多个后续的体外 酶促步骤中通过切割C-肽和可能的N-末端延伸而获得。这些酶促步骤是耗时的，常常是 昂贵的，并且具有引入额外相关杂质（即类似成熟的胰岛素多肽的杂质）的风险。胰岛素 多肽的酵母表达的另一个挑战是胰岛素多肽的0-糖基化。0-糖基化胰岛素多肽也是相关 杂质。对于所有相关杂质而言相同的是，它们在技术上难以除去，并由此在商业纯化工艺中 除去花费多。这是因为需要额外的纯化步骤，通常是色谱步骤，或需要在经济上不利的条件 下操作色谱步骤。相关杂质的结果是，这样的色谱步骤可能在较长周期内、较低的柱载量、 或甚至较低的收率下操作。
[0005] 在制药工业中胰岛素产品越来越多地由胰岛素多肽的衍生物构成并且这类药物 产品越来越多地用于非注射递送。因此，胰岛素市场已经变成竞争性市场并变为每一剂需 要更多胰岛素多肽的产品，所以需要成本上更有效的工艺用于制备胰岛素多肽。
[0006] 因此，需要在工业生产工艺中通过真菌制备人胰岛素或其类似物，其胰岛素前体 分子具有减少的〇-糖基化。也需要具有胰岛素前体的较高收率并且可通过有效和简单的 工艺使得胰岛素前体顺从于C-肽的蛋白水解切除的工业生产工艺。
[0007] 概述 本发明提供新的连接肽（C-肽），当其在转化的微生物、尤其是酵母中表达时，赋予 胰岛素前体分子的高收率。新的连接肽当在真菌例如酵母中表达时也促进通常低水平的 0-糖基化。在具有降低0-糖基化能力的真菌菌株中表达新的胰岛素前体进一步降低了所 表达的0-糖基化的胰岛素前体的比例。这类胰岛素前体随后可通过一个或多个合适的、公 知的转化步骤而转化为人胰岛素、desB30人胰岛素、其它胰岛素类似物或某些胰岛素衍生 物。
[0008] 依据本发明的第一方面，提供了制备成熟人胰岛素或其类似物的方法，即通过 培养包含编码人胰岛素或其类似物的前体的DNA序列的真菌细胞，所述前体具有序列 Z-B-X-Y-A，其中 -Z是任选的延伸序列， -B是人胰岛素或其类似物的B-链， -X是选自以下的序列：X1M、EA、AE、AD、DA和AP，其中X1是包含l-3个氨基酸残基的 序列， -Y是K或R，和 -A是人胰岛素或其类似物的A-链。
[0009] 依据本发明第二方面，提供了包含序列Z-B-X-Y-A的胰岛素前体，其中 -Z是任选的延伸序列， -B是人胰岛素或其类似物的B-链， -X是选自以下的序列：X1M、EA、AE、AD、DA和AP，其中X1是包含l-3个氨基酸残基的 序列， -Y是K或R，和 -A是人胰岛素或其类似物的A-链。
[0010] 依据本发明第三方面，提供了在真菌细胞中表达期间降低人胰岛素或人胰岛素类 似物的前体的〇-糖基化的方法，所述方法包括（i)在表达所述人胰岛素或人胰岛素类似物 的前体的合适培养条件下，培养包含编码人胰岛素或其类似物的前体的DNA序列的真菌细 胞，所述前体具有序列Z-B-X-Y-A，其中 -Z是任选的延伸序列， -B是人胰岛素或其类似物的B-链， -X是选自以下的序列：X1M、EA、AE、AD、DA和AP，其中X1是包含l-3个氨基酸残基的 序列， -Y是K或R，和 -A是人胰岛素或其类似物的A-链。
[0011]依据本发明第四方面，提供了在真菌细胞中表达期间增加人胰岛素或人胰岛素类 似物的前体的收率的方法，所述方法包括（i)在表达所述人胰岛素或人胰岛素类似物的前 体的合适培养条件下，培养包含编码人胰岛素或其类似物的前体的DNA序列的真菌细胞， 所述前体具有序列Z-B-X-Y-A，其中 -Z是任选的延伸序列， -B是人胰岛素或其类似物的B-链， -X是选自以下的序列：X1M、EA、AE、AD、DA和AP，其中X1是包含l-3个氨基酸残基的 序列， -Y是K或R，和 -A是人胰岛素或其类似物的A-链。
[0012] 本发明的方法提供了优于先前描述的通过培养真菌细胞制备成熟人胰岛素或其 类似物的方法的许多优势。例如，已经发现本发明的胰岛素前体在真菌中以非常高的收率 表达。已经惊奇地发现新的胰岛素前体也导致低量的0-糖基化胰岛素前体形式的相关杂 质。进一步发现，通过使用不同的蛋白甘露糖基转移酶敲除菌株，可将低量的〇-糖基化胰 岛素前体甚至进一步降低达2-4倍。因此，目标是提供在真菌中展现高表达水平的胰岛素 前体以及所表达的胰岛素前体具有低水平的〇-糖基化。由于，惊奇地发现同时可通过选择 胰岛素前体中的C-肽以及通过使用PMT调节的菌株二者降低0-糖基化水平，高表达收率 仍然是重要的。
[0013] 降低0-糖基化允许优化上游发酵工艺以及同时优化下游转化和纯化工艺，其中 任何0-糖基化形式最终必须被除去。本发明的胰岛素前体此外通过蛋白酶切割而促进有 效成熟，所述蛋白酶例如水解无色杆菌droazoAacter 蛋白酶（ALP)。因此，发 酵收率、〇-糖基化和ALP切割的这种组合优化的结果允许明显更高的发酵收率，明显更高 的纯化柱载量，和甚至从目前使用的工艺中取消了纯化步骤以及流线型（streamlined)ALP 切割反应步骤。所得全工艺因此增加了生产工厂的能力，同时降低了生产胰岛素多肽所需 的原材料的量。这两种结果都促使胰岛素多肽成本下降。
[0014] 用作表达人胰岛素或人胰岛素类似物的前体的宿主细胞的真菌细胞可以携带降 低其0-糖基化能力的至少一个遗传修饰。本发明的连接肽X-Y，导致从真菌细胞中分泌出 来的胰岛素前体的低0-糖基化。然而，对于一些C-肽，通过在具有降低0-糖基化的能力 的真菌细胞中表达，得到甚至更低水平的0-糖基化。在一个实施方案中，所述降低真菌细 胞ο-糖基化能力的遗传修饰是在PMT1或PMT2的基因内的至少一个遗传修饰。
[0015] 在本发明的一个实施方案中，在序列Z-B-X-Y-A中的连接肽X-Y是XW-Y，其中Xi 是包含1-3个氨基酸残基的序列。因此，一方面本发明涉及胰岛素前体，其包含可从A链和 B链上切割下来的连接肽（X-Y)和包含至少一个Μ和使得A-链和连接肽之间的肽键能够被 切割的切割位点，其中一个Μ是紧接在所述切割位点的Ν-末端。
[0016] 本发明的另一方面涉及胰岛素前体，其包含可从Α链和Β链上切割下来的并由3-5 个氨基酸残基组成的连接肽（C-肽），所述3-5个氨基酸残基其中至少一个是Μ残基。
[0017] 本发明也涉及多核苷酸序列，其编码要求保护的胰岛素前体。再一方面本发明涉 及含有所述多核苷酸序列的载体和含有所述多核苷酸序列或载体的宿主细胞。
[0018] 附图简述 图1显示ρΑΚ1119酿酒酵母（5：ceiwisiae)表达质粒，其表达α*-前导序列（无BglII-位点）（SEQIDN0:l)-EEGEPK(SEQIDN0:2)-胰岛素前体融合蛋白。
[0019] 图2显示pAK1119DNA表达盒的核苷酸序列（SEQIDΝ0:5)和所编码的融合蛋白 (ΡΑΚ1119的α*-前导序列-EEGEPK-胰岛素前体（SEQIDΝ0:6)的推定的氨基酸。
[0020] 图3显示ρΑΚ3768酿酒酵母表达质粒，其表达α2-前导序 列-EEGEPK-B(l-29)-AlaXLys-A(l-21)前体。
[0021] 图4显示pAK3768DNA表达盒的核苷酸序列（SEQIDN0:9)和所编码的融合蛋白 (PAK3768的α2-前导序列-EEGEPK-胰岛素前体（SEQIDN0:10)的推定的氨基酸。
[0022] 图5显示pAK4053酿酒酵母表达质粒，其表达TA39-前导序列-EEGEPK-B(1-29)-A laMetLys-A(1-21)前体。
[0023] 图6显示pAK4053DNA表达盒的核苷酸序列（SEQIDN0:11)和所编码的融合蛋 白（PAK4053的TA39-前导序列-EEGEPK-胰岛素前体（SEQIDN0:12))的推定的氨基酸。
[0024] 描述 依据本发明第一方面，提供了制备成熟人胰岛素或其类似物的方法，即通过培养包含 编码人胰岛素或其类似物的前体的DNA序列的真菌细胞，所述前体具有序列Z-B-X-Y-A，其 中 -Z是任选的延伸序列， -.B是人胰岛素或其类似物的B-链， X是选自以下的序列4M、EA、AE、AD、DA和AP，其中Xi是包含1-3个氨基酸残基的 序列， -Y是K或R，和 -A是人胰岛素或其类似物的A-链。
[0025] 本文使用的术语"胰岛素类似物"是指修饰的人胰岛素，其中胰岛素的一个或多个 氨基酸残基已被其它氨基酸残基取代和/或其中一个或多个氨基酸残基已从胰岛素上缺 失和/或其中一个或多个氨基酸残基已经添加和/或插入到胰岛素。相比人胰岛素，胰岛 素类似物通常会包含不超过大约7个突变、更通常不超过5个和甚至更通常最多3个突变。 在一个实施方案中，相比人胰岛素，胰岛素类似物包含小于10个氨基酸修饰（取代、缺失、 添加（包括插入）及其任何组合），或者相比人胰岛素，小于9、8、7、6、5、4、3、2或1个修饰。
[0026]胰岛素分子中的修饰表示为链（A或B)、位置和取代氨基酸残基的氨基酸残基的 单字母编码。此处的术语如"ΑΓ'、"Α2"和"A3"等分别是指在胰岛素的A链中（自N-末端 开始计数）的位置1、2和3等的氨基酸。同样，术语例如B1、B2和B3等分别是指在胰岛素 的B链中（自N-末端开始计数）的位置1、2和3等的氨基酸。使用氨基酸的单字母编码， 术语如A21A、B28K和B29P是指A21位置的氨基酸是A，位置28和29的氨基酸分别是赖氨 酸和脯氨酸。
[0027] 因此，例如，B28K，B29P人胰岛素是人胰岛素类似物，其中B链中的位置28的氨基 酸被赖氨酸取代，B链中的位置29的氨基酸被脯氨酸取代，A链是A(1-21)