适的寡核苷酸产生所需序列。
[0051] 本发明包括这样的载体，其在所选的微生物或宿主细胞中能够复制并且其携带编 码本发明的胰岛素前体或胰岛素前体类似物的多核苷酸序列。重组载体可以是自主复制载 体，即以染色体外实体形式存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如质粒，染色体外元 件、小染色体、或人工染色体。载体可含有任何用于确保自我复制的元件。或者，载体可以 是这样的载体：当将其引入宿主细胞时，其整合到基因组中并与其整合入的染色体一起复 制。此外，可以使用单个载体或质粒或两个或更多个载体或质粒，其共同含有有待引入宿主 细胞基因组的总DNA或转座子。载体可以是线性的或闭合环状的质粒并且优选会含有允许 将载体稳定整合到宿主细胞基因组中或允许载体在细胞中独立于基因组自主复制的元件。
[0052] 在一个优选的实施方案中，重组表达载体能够在酵母中复制。使载体能够在酵母 中复制的序列的实例是酵母质粒2μ复制基因REP1-3和复制起点。
[0053] 本发明的载体优选地含有一个或多个选择标志物，其允许容易选择转化的细胞。 选择标志物是这样的基因，其产物提供杀生物剂或病毒抗性、重金属抗性、向营养缺陷型提 供原养型等。细菌选择标志物的实例是枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆 菌的i/aJ基因，或赋予抗生素抗性的标志物，所述抗生素抗性 例如氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素或四环素抗性。用于丝状真菌宿主细胞的选择标志物包 括(乙酰胺酶）、ar试（鸟氨酸氨甲酰基转移酶）、Arri；(乳清酸核苷-5'-磷酸脱 羧酶）和(邻氨基苯甲酸合酶）。用于酵母宿主细胞的合适标志物的实例是ADE2、 HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1和URA3。用于酵母的优选的选择标志物是粟酒裂殖酵母TPI 基因（Russell(1985)Gene40:125-130)。
[0054] 载体中，多核苷酸序列与适宜的启动子序列操作性连接。该启动子可以是在所选 的宿主细胞中显示转录活性的任何核酸序列，包括突变的、截短的和杂交的启动子，而且可 获自编码与宿主细胞同源或异源的胞外或胞内多肽的基因。
[0055] 用于指导在细菌宿主细胞中转录的合适的启动子的实例是得自以下的启动子：大 肠杆菌Jac操纵子、天蓝色链霉菌琼脂糖酶基因（办以人枯 草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因（mci?入地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因人嗜热脂肪 芽孢杆菌OfeciWiAs· 麦芽糖淀粉酶基因（amyM)、解淀粉芽孢杆菌 (ifeciWiAsa野ioJi识/e/aciefts·)α-淀粉酶基因（a?j必>和地衣芽孢杆菌青霉素酶基因 (/^/7尸人用于指导在丝状真菌宿主细胞中的转录的合适的启动子的实例是得自以下基因的 启动子：米曲霉（J5per^77/i/6·orjzaeOTAKA淀粉酶、米赫根毛霉鹽/corazieAei)天 冬氨酸蛋白酶、黑曲霉fliger)中性α-淀粉酶和黑曲霉酸稳定α-淀粉酶。 在酵母宿主中，有用的启动子的实例是酿酒酵母MFα1、ΤΡΙ1、ADH、TDH3或PGK启动子。
[0056] 本发明的多核苷酸构建体一般也会与合适的终止子操作性连接。在酵母中，合适 的终止子是ΤΡΙ1 终止子（Alber等人（1982)J.Mol.Appl.Genet. 1:419-434)。
[0057] 分别用于连接本发明的多核苷酸序列、启动子和终止子，并将它们插入合适的含 有酵母复制所需信息的酵母载体中的程序，是本领域技术人员周知的。可以理解，所述载 体可以通过如下构建：首先制备含有编码本发明的胰岛素前体或胰岛素前体类似物的完整 DNA序列的DNA构建体，然后将该片段插入合适的表达载体，或者序贯地插入含有单独元件 (例如信号、原肽、小C-肽、A链和B链）的遗传信息的DNA片段，接着连接。
[0058] 本发明也涉及重组宿主细胞，其包含编码本发明的胰岛素前体或胰岛素前体类似 物的多核苷酸序列。将包含这类多核苷酸序列的载体引入宿主细胞，使得该载体作为染色 体整合体或作为自我复制的染色体外载体而维持。
[0059] 本文使用的"宿主细胞"意图是指用于表达目标多肽的微生物。宿主细胞包括亲 本细胞的因复制期间发生突变所致与亲本细胞不相同的任何后代。
[0060] 本发明合适的宿主细胞是真菌细胞。本文使用的"真菌"意图包括子囊菌 门（Ascomycota)、担子菌门（Basidiomycota)、壶菌门（Chytridiomycota)和接合菌门 (Zygomycota)(如Hawksworth^X,载于AinsworthandBisby'sDictionaryofThe Fungi,第 8 版，1995,CABInternational,UniversityPress,Cambridge,UK所定 义）以及卵菌门（Oomycota)(如Hawksworth等yl, 1995,同上，页数171中引用的） 和所有有丝分裂孢子真菌（Hawksworth等>1，1995，同上）。
[0061] 在一个实施方案中所述宿主细胞是酵母细胞。本文使用的"酵母"包括产子囊酵母 (内孢霉目（Endomycetales))、产担孢子（basidiosporogenous)酵母和属于半知菌的酵母 (芽生菌属（Blastomycetes))。产子囊酵母分为蚀精霉科（Spermophthoraceae)和酵母科 (Saccharomycetaceae)。后者包含四个亚科，裂殖酵母亚科（Schizosaccharomycoideae) (例如，粟酒裂殖酵母属（Schizosaccharomyces))、拿逊酵母亚科（Nadsonioideae)、月旨 酵母亚科（Lipomycoideae)和多极出芽酵母亚科（Saccharomycoideae)(例如，毕赤氏酵 母属（/YcAia)、克鲁维氏酵母属和酵母属)。产担 孢子酵母包括白冬孢酵母属（Zei/coSjOarii/ia?)、红冬孢属、锁掷酵母属 线黑粉酵母属和线黑粉菌属属 于半知菌的酵母分作两个科，掷抱酵母科（Sporobolomycetaceae)(例如， 和布氏掷孢酵母属（SWWera))和隐球菌科（Cryptococcaceae)(例如，假丝酵母属 由于酵母分类将来可能发生变化，所以为了本发明的目的，酵母应按照 Biology and Activities of Yeast(Skinner，F.A.，Passmore，S.M.，和Davenport，R.R.编辑，Soc.App.Bacteriol.SymposiumSeriesNo. 9,1980)所述的进行定义D 酵母 的生物学和酵母遗传学操作是本领域周知的（参见例如，a/?" 6?/ Bacil，Μ·，Horecker，Β·J.和Stopani，Α· 0·Μ·编辑，第 2 版，1987 ;没6> Rose，A.Η·，和Harrison，J.S.编辑，第 2 版，1987 ;以及TXe 价6^收76?/ 姆^6\s，Strathern等编辑，1981)。
[0062] 用于本发明的工艺的酵母宿主细胞可以是任何合适的酵母生物体，其在培养时产 生大量的本发明的胰岛素前体和胰岛素前体类似物。
[0063] 合适的酵母生物体的实例是选自以下物种的细胞的菌株：假丝酵母属 、克鲁维氏酵母属、酵母属、裂殖酵母 属、毕赤氏酵母属（/YoAia)、汉逊氏酵母属（他/?^^/?"^) 和耶罗威亚酵母属。在一个实施方案中，酵母宿主细胞选自卡氏酵母 (Saccharomyces carlsbergensis)> -?{Saccharomyces cerevisiae)>fj| 母{Saccharomyces diastaticu^)、道路技氏裔母{Saccharomyces douglasif)、兔亀维酵母通尺⑶、诺地酵母通尺⑶、卵形酵 母（免aAar咖尺6woKi/oii/s)、粟酒裂殖酵母葡萄汁 酵母i/rar·)、克鲁维毕赤酵母解脂耶罗威亚酵 母（/a/ror/a 产版假丝酵母可可假丝酵母 和发酵地霉其它可用的酵母宿主细胞是乳酸克鲁 维酵母heii*s)、脆壁克鲁维酵母、多形汉 逊氏酵母巴斯德毕赤酵母解脂耶罗威亚 酵母粟酒裂殖酵母玉米黑粉 菌（/Zsh7职舰7_/i5〇、麦芽糖假丝酵母Ts^iose)、季也蒙氏毕赤酵母 沿和甲醇毕赤酵母茁(参看Gleeson等人，.1.Gen. Microbiol. 132, 1986,第 3459-3465 页；US4, 882, 279 和US4, 879, 231)。酵母细胞转化 可以例如以本来已知的方式通过原生质体形成、随后转化而实现。
[0064] 在一个实施方案中所述宿主细胞是丝状真菌细胞。"丝状真菌"包括真菌 门（Eumycota)和卵菌门亚部的所有丝状形式（由Hawksworth等人，1995,同上，所定 义）。丝状真菌宿主细胞可选自支顶孢属C4<^r67^/?i?)、曲霉属（AsT^rgiWiAs)、镰孢 属（Fusariuni)、腐质霉M (Humicola)、毛霉M (Mucoi)、毁丝^霉M (Myceliophthora)、 链孢霉属（Afewrospora)、青霉属、梭孢壳属（TXiehKia)、弯颈霉属 iTolypocladiwi)你木霉罵iTrichodennd)。
[0065] 用于表达胰岛素前体的宿主细胞优选地是不含任何功能性抗生素抗性基因的细 胞。尽管这样的抗生素抗性基因在例如大肠杆菌中的起始克隆步骤中有用，但可通过周知 的程序使抗生素抗性基因无功能或从宿主细胞中移除，所述程序参见例如W0 00/04172。
[0066] 本文使用的"培养基"意图是指培养宿主细胞、即支持真菌的生长和产物形成的液 体溶液。真菌的合适培养基是例如YPD或如W02008/037735中所述^培养基含有至少一种 碳源、一种或几种氮源、必需的盐（包括钾、钠、镁、磷酸盐和硫酸盐的盐）、痕量金属、水溶 性维生素和加工助剂（包括但不限于消泡剂、蛋白酶抑制剂、稳定剂、配体和诱导剂）。典型 的碳源是例如单糖或双糖。典型的氮源是例如氨、尿素、氨基酸、酵母提取物、玉米浸出液以 及完全和部分水解蛋白。典型的痕量金属是例如Fe、Zn、Mn、Cu、Mo和Η3Β03。典型的水溶 性维生素是例如生物素、泛酸盐、烟酸、硫胺素、对氨基苯甲酸、胆碱、吡哆醇、叶酸、核黄素 和抗坏血酸。
[0067] 本文使用的"发酵"意图是指用于繁殖浸泡在液体培养基中的微生物的无菌工 艺。发酵优选地是在无菌的搅拌罐中进行，所述搅拌罐具有补给管线，用于添加压缩的无菌 气体，所述气体由空气、氧气和氨气组成但不限于这些。发酵罐可具有传感器和装置，以监 测PH、温度、压力、搅拌速率、溶解氧水平、液体含量、泡沫水平、加料速率和添加酸和碱的速 率。此外，发酵罐可以装备有光学装置，以监测细胞密度水平、代谢物和产物浓度，无论其理 化形式如何。
[0068] 发酵期间产生的所需产物作为可溶性胞外材料或者作为呈可溶性材料或不可溶 材料（包括聚集材料）形式的胞内材料存在。发酵工艺通常在罐中进行，罐的工作体积范 围在100mL至200. 000L。发酵工艺可以以分批工艺、补料-分批工艺、重复补料-分批工 艺或连续工艺来操作。
[0069] 可通过常规程序从培养基中回收所分泌的胰岛素前体或胰岛素类似物前体（其 重要部分会以正确加工形式存在于培养基中），所述常规程序包括通过离心从培养基中分 离酵母细胞，通过离子交换基质或通过反相吸收基质来过滤或捕获人胰岛素或其类似物的 前体，通过盐例如硫酸