一种鸡红细胞的制备和储存方法
【专利摘要】本发明公开了一种鸡红细胞的制备和储存方法，其步骤包括：采集成年健康公鸡的肝素钠抗凝静脉血，并分别采用如下步骤进行纯化：明胶沉降法去除白细胞，乙二胺四乙酸处理去除细胞之间的黏连，低速离心法去除血小板和细胞碎片；将纯化的鸡红细胞固定和保存于戊二醛溶液；定期染色，检测鸡红细胞DNA在流式细胞仪检测中的X轴半高峰变异系数（CV），在10%以内的可用。本发明获得的鸡红细胞CV值符合市售标准，且操作简便、可重复性强，可开发作为市售商品。
【专利说明】一种鸡红细胞的制备和储存方法
[0001]
【技术领域】
[0002]本发明属于医疗检测用试剂领域，具体涉及流式细胞仪校准用鸡红细胞的制备与储存。
【背景技术】 [0003]流式细胞术是近二十年来发展起来的新技术，该方法灵敏度高，操作便利，且可提供细胞的多方面信息，因此被广泛应用于生物学、临床医学及制药学等领域的研究中。但在实际使用中，流式细胞仪需要采用校准试剂来进行校准与稳定性分析，之后才能进行样品检测。鸡红细胞是流式细胞仪变异系数(CV)校准和稳定性评估的主要试剂之一。此外，由于DNA含量是人类正常组织细胞的I/ 3，将鸡红细胞加入人组织细胞样品中，共同染色，在流式细胞仪上能与人正常细胞或超二倍体细胞峰完全分开，因而它还可用于检测正常组织细胞或肿瘤细胞的DNA倍体，诊断肿瘤的恶性程度及判定预后。然而目前市售鸡红细胞均来至于进口，价格昂贵且供货周期长。给临床试验带来了很多不便。
[0004]在胡凡等人发表的论文(胡凡，王玲，大型流式细胞仪质量控制方法的探讨。南京医科大学学报(自然科学版)，2005.25(3): p.211-213)中提出，用磷酸缓冲盐溶液洗涤去除血浆与血小板的粗分离方法，可获得鸡红细胞并替代荧光微球进行流式细胞仪的校准。但该方法较为粗略，无法去除去红细胞中的白细胞、黏连红细胞以及细胞碎片，导致获得的鸡红细胞不纯，在流式细胞仪上的检测CV值甚至在12%以上，不符合市售鸡红细胞CV值低于10%的标准。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供一种鸡红细胞的制备和储存方法，主要用于去除鸡红细胞中混杂的白细胞、细胞碎片及黏连红细胞，降低其在流式细胞仪上检测到的CV值。
[0006]为实现上述技术目的，达到上述技术效果，本发明通过以下技术方案实现:
一种鸡红细胞的制备和储存方法，包括以下步骤:
步骤I)将收集到的肝素钠抗凝血在4°c下暂时保存，并尽快进行分离处理；
步骤2)按照1:1的比例将静脉血与质量浓度为3-6%的明胶溶液混合，4°C下静置分
层；
其中明胶溶液配方为:明胶3-6 g，磷酸二氢钾0.15-0.34 g、磷酸氢二钠1.12-1.68 g、氯化钠6-9 g及氯化钾0.3-0.5 g,加去离子水配成I L溶液。
[0007]步骤3)去除上层的白细胞,将下层红细胞转移入eppendorf管中，用稀释液按照适当比例将其稀释至1-5X107 cells/mL, 150-300 rpm的低速离心,去除上清液；
其中稀释液配方为:氯化钾0.3-0.5 g、磷酸二氢钾0.04-0.07 g、碳酸氢钠0.25-0.45g、氯化钠6-9 g、磷酸氢二钠0.02-0.06 g、葡萄糖0.8-1.2 g及乙二胺四乙酸0.15-0.38g，加去离子水配成I L溶液。
[0008]步骤4)收集下层的鸡红细胞固定及保存于1-3%戊二醛溶液中，其终密度为1-2XIO7 cells/mL ；
其中戊二醛溶液配方为:戊二醛100 mL、磷酸二氢钾0.15-0.34 g、磷酸氢二钠1.12-1.68 g、氯化钠6-9 g及氯化钾0.3-0.5 g混合，加去离子水配成I L溶液。
[0009]步骤5)取固定后的鸡红细胞，每隔30 d用碘化丙啶染色，流式细胞仪检测CV值，确定其可用性 ；
优选的，其中碘化丙啶溶液配方为:碘化丙啶0.03-0.07 g、曲拉通0.5-1.5 mL、RnaseA酶0.03-0.07 g、磷酸二氢钾0.15-0.34 g、磷酸氢二钠1.12-1.68 g、氯化钠6-9 g、氯化钾0.3-0.5 g及乙二胺四乙酸0.15-0.38 g溶解于I L去离子水中。
[0010]进一步的，细胞分离过程保持在4°C进行，以保证细胞的存活。
[0011]进一步的,步骤I)中的肝素钠使用浓度为每10-30 U/mL血液。
[0012]进一步的，步骤2)、3)、4)及5)中均用氢氧化钠将溶液PH调整为7.2_7.4。
[0013]进一步的，步骤5)中碘化丙啶染色温度和时间需控制在37°C及15-30 min之间。
[0014]进一步的，步骤5)中鸡红细胞检测CV值应维持在10%以下方可进行流式细胞仪校准和DNA检测。
[0015]本发明的有益效果是:
1.改变国内流式细胞仪用鸡红细胞长期依赖进口的现状，试剂由国内生产销售，可大大降低流式细胞仪的应用成本。
[0016]2.本方法所采用的鸡红细胞分离方法，还可用于粗分离细胞的进一步提纯，降低CV值,使其可用于流式细胞仪的校准。
[0017]3.本方法分离提纯的鸡红细胞除符合流式细胞仪的应用要求外，还能够在至少72 h内维持鸡红细胞的良好活性，且分散态良好，从而为细胞融合等生物学实验中的鸡红细胞制备提供了可选方案。
[0018]4.本方法中所有试剂均可在带菌条件下进行，并能够实现鸡红细胞的长期保存，从而避免了无菌操作的复杂步骤，降低细胞制备成本。
【专利附图】
【附图说明】
[0019]图1为本发明新鲜分离鸡红细胞的胎盘蓝染色结果图，放大倍数为400倍；
图2为本发明新鲜分离鸡红细胞的流式细胞仪检测结果图；
图3为本发明储存90 d后鸡红细胞的流式细胞仪检测结果图。
【具体实施方式】
[0020]下面将参考附图并结合实施例，来详细说明本发明。
[0021]如不做特殊说明，以下实施例中用到的试剂均为分析纯试剂。
[0022]一、鸡红细胞提取纯化
(I)将新鲜采集的肝素钠抗凝鸡红细胞在4°C下暂时保存，并尽快进行分离处理。
[0023](2)将抗凝静脉血按照1:1的比例与3%的明胶溶液混合，静置使溶液分层。
[0024]优选的，明胶溶液配方为:优质明胶30 g，磷酸二氢钾0.27g、磷酸氢二钠1.42 g、氯化钠8 g及氯化钾0.2 g，溶解于I L去离子水中，沸水浴加热溶解，4°C保存待用。
[0025](3)去除上层溶液，并将下层红细胞用稀释液重悬，静置10 min后，200 rpm的转速离心细胞3 min，去除上清溶液。最终向沉积的细胞中加入稀释液重悬，0.3%胎盘蓝拒染法检测悬浮细胞活率(戴建军，芮荣，武彩红，葛立军，卢庆猪，GV期卵母细胞玻璃化冷冻保存技术研究。西北农林科技大学学报(自然科学版)，2007.35(8): p.34-38),可知基本在95%以上。参见图1所示，新鲜分离的鸡红细胞经胎盘蓝染色后的形态，放大倍数为400倍。
[0026]优选的，稀释液配方为:氯化钾0.4 g、磷酸二氢钾0.06 g、碳酸氢钠0.35 g、氯化钠8 g、磷酸氢二钠0.048 g、葡萄糖I g及乙二胺四乙酸0.29 g，溶解于IL去离子水中，NaOH 调节 PH 为 7.2-7.4。 [0027]二、鸡红细胞的固定储存
(4)分离后的鸡红细胞，1000rpm离心，去除上清液，加入2.5%戊二醛，调整其密度为IXlO7 cells/mL，置于4°C冰箱中固定保存。
[0028]优选的，戊二醛固定溶液配方为:25%戊二醛100 mL，磷酸二氢钾0.27 g、磷酸氢二钠1.42 g、氯化钠8 g及氯化钾0.2 g,去离子水900 mL溶解，NaOH调PH为7.2-7.4。
[0029]三、流式细胞仪检测及校准
(5)每隔30d，取100 μ L新鲜或固定后的鸡红细胞，加入稀释液洗涤，200 rpm离心，弃上清。向沉积细胞中加入I mL碘化丙啶染液，37°C下染色20 min，稀释液洗涤并调整细胞密度至 IXlO6 cells/mL
优选的，碘化丙啶染液配方为:碘化丙啶0.05 g、曲拉通I mL、Rnase A酶0.05 g、磷酸二氢钾0.2 g、磷酸氢二钠1.42 g、氯化钠8 g、氯化钾0.4 g及乙二胺四乙酸0.29 g溶解于I L去离子水中，NaOH调节PH为7.2-7.4。
[0030](6)染色后的鸡红细胞经400目滤网过滤，用流式细胞仪检测，以FL2+H为横坐标，counts为纵坐标，可得鸡红细胞的CV值约在5-7 %之间，低于市售要求的10%，也优于国内文献报道的12% CV值。参见图2.、3所示，新鲜分离及保存90 d后的鸡红细胞CV值分别为6.2%及5.8%，证明其可用于流式细胞仪校准。
[0031]上述实施例只是为了说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让本领域内的普通技术人员能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡是根据本
【发明内容】
的实质所作出的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。
【权利要求】
1.一种鸡红细胞的制备和储存方法，其特征在于，包括以下步骤: 步骤I)将收集到的肝素钠抗凝血在4°c下暂时保存，并尽快进行分离处理； 步骤2)按照1:1的比例将静脉血与质量浓度为3-6%的明胶溶液混合，4°C下静置30-90min分层，并去除上层的白细胞； 步骤3)将下层红细胞转移入eppendorf管中，用含0.15-0.38 g乙二胺四乙酸的稀释液按照适当比例将其稀释至1-5 X IO7 cells/mL, 150-300 rpm的低速离心,去除上层细胞碎片与血细胞； 步骤4)将纯化后的鸡红细胞固定及保存于1-3%戊二醛溶液中，并将其终密度调整为1-2XIO7 cells/m ； 步骤5)取固定后的鸡红细胞，每隔30 d用碘化丙啶染色，流式细胞仪检测其CV值，确定其可用性。
2.根据权利要求1所述的鸡红细胞分离和储存方法，其特征在于:细胞分离过程保持在4°C进行，以保证细胞的存活。
3.根据权利要求1所述的鸡红细胞分离和储备方法，其特征在于:步骤I)中的肝素钠使用浓度为每10-30 U/mL血液。
4.根据权利I所述的鸡红细胞分离和储备方法，其特征在于:步骤2)、3)、4)及5)中的溶液PH为7.2-7.4。
5.根据权利要求1所述的鸡 红细胞分离和储存方法，其特征在于:步骤5)中碘化丙啶染色温度和时间需控制在37°C及15-30 min之间。
6.根据权利要求1所述的鸡红细胞分离和储存方法，其特征在于:步骤5)中，鸡红细胞检测CV值应维持在10%以下方可进行流式细胞仪校准和DNA检测。
【文档编号】C12N5/078GK103540565SQ201210246076
【公开日】2014年1月29日 申请日期:2012年7月17日 优先权日:2012年7月17日
【发明者】武晓东, 殷建, 王策 申请人:苏州生物医学工程技术研究所