专利名称：一种治疗白癜风的黑素细胞悬液制剂及其制备方法
技术领域：
本发明属生物制品领域，涉及一种治疗白癜风的悬液制剂，具体涉及一种治疗白癜风的黑素细胞悬液制剂及其制备方法。
背景技术：
白癜风是一种原发性的局限或泛发的色素脱失性皮肤疾病，正常人群发病率为1-2％。研究认为其发病机制是多基因遗传的、在多种内外因子的激发下表现为免疫功能紊乱，导致黑素细胞的破坏，终致色素脱失，病理表现为皮损处黑素细胞消失。临床上表现的色素脱失斑给病人生理和病理上带来极大负担。目前尚无有确切疗效的治疗方法，部分顽固型患者对于常规口服或外用药治疗反应不佳。对于顽固型白癜风，国内主要采用自体表皮移植术，但存在供皮及取皮区留下疤痕让患者难以接受等问题。国外采用自体黑素细胞培养移植治疗，但患者可能存在的黑素细胞功能异常则会影响自体黑素细胞培养后移植的疗效。自Eisinger和Markjo首次使用化学促分裂剂12-o-十四烷酰佛波醇-13-乙酯(TPA，12-o-Tetradecanoyl phorbol-13-Acetate)，霍乱毒素(CT，choleratoxin)体外培养黑素细胞获得成功以来，这种培养方法一直被广泛应用。但TPA在促黑素细胞分裂的同时使黑素细胞表达黑素瘤相关抗原并刺激黑素细胞表达HLA-DR抗原，从而使培养黑素细胞的临床应用受到限制。
发明内容
本发明的目的是提供一种治疗顽固性白癜风的黑素细胞悬液制剂及其制备方法。
本发明采用正常人包皮环切术后废弃的组织，用郑氏法分离表真皮后由表皮基底层处获取黑素细胞，然后应用体外细胞培养技术，由培养液中加入生理分泌的生物因子促黑素细胞分裂，进行细胞培养和扩增及鉴定，调节细胞密度1-10×105/mL，制成黑素细胞悬液制剂。
本发明改进了黑素细胞培养促分裂因子的成分，以生理分泌的bFGF、ET-1及α-MSH等生物因子(可市购)取代化学促分裂剂TPA、CT，建立安全高效的纯化黑素细胞培养方法。黑素细胞在已知的生物反应器中和微载体系统中经贴壁，悬浮，大量培养和扩增，用分子生物学、免疫组化和超微结构测定等鉴定培养后黑素细胞的形态和功能状态，并经冷冻，复苏后保持一定的活率和维持其生物学特性，制成黑素细胞悬液制剂，用高压高速液体流透皮注射技术简化异体黑素细胞移植的操作方法后供临床试验应用。
本发明的制备方法包括下述步骤，1、黑素细胞的培养及冻存和复苏，2、在生物反应器中和微载体系统中大量培养和扩增，3、黑素细胞的形态和功能及遗传性状稳定性生物学鉴定，4、制备黑素细胞悬液制剂。
本发明利用正常人来源的黑素细胞，经安全、高效的体外纯化培养后进行同种异体移植治疗难制性白癜风。经临床试用，证实黑素细胞同种异体移植治疗白癜风可治疗顽固性白癜风，且效果佳。
本发明用于顽固性白癜风的治疗具有以下优点1)避免了表皮移植方法中所需大量的取皮区，解决了供皮问题，能减少移植治疗的痛苦，2)避免了因白癜风患者自身黑素细胞的遗传缺陷造成表皮移植和自体细胞移植的失败，为白癜风的治疗提供新的手段，3)为无细胞培养条件的医院提供方便，扩展黑素细胞移植治疗白癜风的工作范围。
图1是体外培养黑素细胞生物学鉴定结果，多巴染色阳性。
图2是体外培养黑素细胞脱黑素染色结果。
图3是体外培养黑素细胞的透视电镜超微结构。
具体实施例方式
实施例1 黑素细胞的培养及冻存和复苏取包皮环切术标本，去除皮下组织后分割成2×2cm的小片，0.25％胰蛋白酶4℃消化过夜。将消化后的表皮置于MCDB153培养液中，吹打成单细胞悬液，离心后计数。按4～6×106/ml的密度接种于φ＝35mm或60mm培养皿中，2～3周后传代2-5代，常规方法冻存，备用。
所述MCDB153培养液中，其成分为碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)0.1～1.0ng/ml，内皮素(ET-1)2～15nmol/L，黑素细胞刺激激素(MSH)2～15nmol/L，氢化考的松0.5mg/ml，青霉素100U/ml，链霉素0.1mg/ml，两性霉素0.5mg/ml。
实施例2 黑素细胞的形态和功能及遗传性状稳定性生物学鉴定采用特殊染色即多巴染色和脱黑素染色、免疫组化方法以及透射电镜技术对体外培养的黑素细胞的生物学特性进行鉴定。结果显示，体外培养的黑素细胞的结构和功能保持正常。
1.多巴染色证实黑素细胞的多巴酶功能正常，脱黑素染色从另一侧面证实细胞内的黑素是真正的黑素。
2.已知常规方法进行遗传性状鉴定，结果表明，HMSA-5、HMSA-1、HMB45单克隆抗体证实培养的黑素细胞无间变和恶变，遗传性状稳定。
3.形态和功能电镜结果显示，黑素细胞内与合成功能有关的细胞器非常丰富，如核糖体、内质网、线粒体和高尔基复合体等，含有不同阶段的黑素小体，黑素小体的分布、输送均正常。
实施例3 同种异体黑素细胞移植实验黑素细胞表面HLA-DR抗原的表达由于在排斥免疫反应中，HLA-II类抗原，特别是HLA-DR抗原是强有力的免疫原，本发明对正常人黑素细胞表面HLA-DR抗原的表达进行免疫组化测定，结果证实，正常人黑素细胞表面不表达HLA-DR抗原，为同种异体移植的可行性提供了理论依据。
黑素细胞同种异体移植体外模型实验黑素细胞与同种异体淋巴细胞混合培养，作为同种异体黑素细胞移植的体外模型，观察体外实验的排斥反应。采用3H-dTR掺入同位素液态闪烁计数法测定淋巴细胞的转化增殖率，并用透射电镜观察混合培养后黑素细胞的超微结构。结果显示，1.黑素细胞对同种异体淋巴细胞的转化增殖率与ConA刺激淋巴细胞转化增殖的阳性对照比较，黑素细胞的促淋巴细胞转化增殖的特异性抗原作用较弱。
2.黑素细胞对不同病期白癜风患者淋巴细胞的影响，显示黑素细胞对活动期白癜风患者淋巴细胞的刺激作用相对较强，而稳定期患者和正常人对照组结果差异无显著性。
3.电镜结果显示同种异体的淋巴细胞对黑素细胞无明显损伤，黑素细胞经混合培养后，细胞的形态完整，黑素合成功能正常，胞体和树突无损伤。细胞内细胞器丰富，胞浆内可见大量的不同阶段黑素小体。
4.正常人黑素细胞的促淋巴细胞转化增殖的特异性抗原作用较弱。同种异体淋巴细胞对黑素细胞超微结构无破坏作用。
黑素细胞同种异体移植动物实验将取自黑色的C57BL/6的无毛红皮3天小鼠的黑素细胞经体外培养后，移植给白色的昆明小鼠和白色的ICR小鼠。观察4个月，在注入MC部位无红肿等炎症反应。表明，体外培养的纯化的MC抗原性弱，不引起宿主的排斥反应。
实施例4 黑素细胞同种异体移植的临床试验制备细胞悬液0.25％胰蛋白酶将培养的黑素细胞37℃消化10分钟，加入10％小牛血清MCDB153培养液中止反应。将细胞悬液集于离心管，1500转/分离心5～10分钟。用缓冲液D-Hanks液洗涤3～4次，调节细胞密度2-3×105/mL，制备细胞悬液以备用。
临床试用，选择稳定期患者23例64处皮片进行黑素细胞的同种异体移植，患者皮损处吸疱准备用负压为80.0kPa的真空泵在患者皮损处吸取直径0.8cm~1.0cm的水疱，使表、真皮分离。
细胞移植用针筒抽去疱液，注入上述细胞悬液0.2～0.3mL，包扎固定。结果显示，患者在培养MC移植后2周随访，无红肿等炎症反应，大部分患者皮损处疱液吸收，疱壁脱落，色素出现；随访至1月～4月，色素持续存在。证实黑素细胞同种异体移植治疗白癜风可治疗顽固性白癜风，且效果佳。
权利要求
1.一种治疗白癜风的黑素细胞悬液制剂，其特征是以黑素细胞为活性成分，缓冲液D-Hanks为溶剂，制成黑素细胞悬液制剂，所述黑素细胞密度为1-10×105/mL。
2.按权利要求1所述的黑素细胞悬液制剂，其特征是所述黑素细胞密度为2-3×105/mL。
3.按权利要求1所述的黑素细胞悬液制剂，其特征是所述黑素细胞是采用正常人术后废弃组织获取后，应用体外细胞培养技术，由培养液中加入生理分泌的生物因子取代化学促分裂剂TPA、CT，促黑素细胞分裂，进行细胞培养和扩增及鉴定所得。
4.按权利要求3所述的黑素细胞悬液制剂，其特征是所述黑素细胞通过0.25％胰蛋白酶37℃消化10分钟，加入10％小牛血清MCDB153培养液中止反应，1500转/分离心5～10分钟，用D-Hanks液洗涤后，制备成黑素细胞悬液。
5.按权利要求3所述的黑素细胞悬液制剂的制备方法，其特征是所述生理分泌的生物因子是碱性成纤维细胞生长因子bFGF、内皮素ET-1及黑素细胞刺激激素α-MSH生物因子。
6.按权利要求5所述的方法，其特征是所述成分，bFGF浓度是0.1～1.0ng/ml，ET-1浓度是2～15nmol/L，MSH浓度是2～15nmol/L。
7.一种治疗白癜风的黑素细胞悬液制剂的制备方法，包括下述步骤，1)黑素细胞的培养及冻存和复苏，2)在生物反应器中和微载体系统中大量培养和扩增，3)黑素细胞的形态和功能及遗传性状稳定性生物学鉴定，4)制备黑素细胞悬液制剂。
全文摘要
本发明属生物制品领域，涉及一种治疗白癜风的悬液制剂，具体涉及一种治疗白癜风的黑素细胞悬液制剂及其制备方法。本发明利用正常人来源的黑素细胞，以生理分泌的生物因子取代化学促分裂剂TPA、CT促黑素细胞分裂，制成黑素细胞悬液制剂。经临床试用，证实本发明黑素细胞同种异体移植可治疗顽固性白癜风，且效果佳。本发明解决了表皮移植供皮问题，能减少移植治疗的痛苦，避免了因白癜风患者自身遗传缺陷造成表皮移植和自体细胞移植的失败，为白癜风的治疗提供新的手段，为基层医院提供方便，扩展黑素细胞移植治疗白癜风的工作范围。
文档编号A61P17/00GK1544091SQ20031010890
公开日2004年11月10日 申请日期2003年11月27日 优先权日2003年11月27日
发明者郑志忠, 项蕾红, 祝绿川, 何怡, 黄琼 申请人:复旦大学附属华山医院