一种含有茶黄素及其衍生物的组合物、以及其制备和用途的制作方法

专利名称：一种含有茶黄素及其衍生物的组合物、以及其制备和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种含有茶黄素及其衍生物的组合物，以及其制备方法和用途。
背景技术：
茶黄素是指具有二羟基苯骈酚酮结构(1’，2’-二羟基-3，4-苯骈酚酮)的一类物质，是在绿茶发酵过程中由成对的儿茶素氧化聚合而成，所以茶黄素主要存在于红茶、乌龙茶中。茶黄素的含量高低是评判红茶品质的主要标准。近年来的医学研究发现茶黄素在体外试验中表现出抗氧化、抑菌、抑制病毒、诱导癌细胞的调亡和抑制原癌基因的表达以及干涉脂质代谢、抗LDL氧化等多种生物学活性，是一个可用于预防、治疗癌症，预防、治疗心血管疾病，调节血糖，对抗爱滋病毒，预防感冒、SARS等疾病的活性成分。然而由于茶黄素具有多酚结构，在空气中极易被氧化，口服后也容易在肠道遇碱氧化，口服生物利用度仅为0.0006％(Theo P.J.Mulder et al.，2001，Journalof ChromatograpHy B，760(2001)271-279)，而且茶黄素还具有强烈的收敛作用，对胃肠道刺激大，因而限制了茶黄素的临床应用。
脂质体(Liposome)是一种新的药物释放系统，具有一定的靶向性。它可以将药物粉末或溶液包埋于类脂质双分子微粒中，这种微粒具有类细胞结构，使药物靶向于特定的组织，改善药物的体内分布，并对极易氧化水解的药物具有保护作用，还能延缓药物的释放，从而提高药物的生物利用度、减少药物的剂量、降低药物的毒副作用。

发明内容
本发明的目的是解决上述课题，提供一种含有茶黄素和\或其衍生物的组合物，这个组合物是指含有茶黄素和\或其衍生物的脂质体。
本发明另一目的是提供上述组合物的制备方法。
本发明再一目的是提供上述组合物的用途。
本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现本发明所述的茶黄素和\或其衍生物的组合物，其特征在于由按以下重量配比的组分组成茶黄素和\或其衍生物1～5份，磷脂20～200份，胆固醇2～30份，辅助剂0.5～50份。
上述组合物还可以含有茶多酚0～20份。
其中，所述的茶黄素(theaflavins，TFs)是指含具有二羟基苯骈酚酮结构(1’，2’-二羟基-3，4-苯骈酚酮)的一类物质，包括但不仅限于茶黄素(Theaflavin，TF1)，茶黄素-3-单没食子酸脂(theaflavin-3-gallate，TF2A)，茶黄素-3’-单没食子酸脂(theaflavin-3’-gallate，TF2B)，茶黄素-3，3’-双没食子酸脂(theaflavin-3.3’-digallate，TF3)的一种或它们的任意组合，以及它\它们与其它多酚的任意混合物，该组分的制备方法见中国专利“茶黄素的新用途”(申请号02111512.5)以及“高活性茶色素及其生产方法”(申请号00112536.2)。
本发明中的茶黄素的通式如下 其中R1为H或G；R2为H或G；G为
茶黄素衍生物是指上述所指的茶黄素与一些氨基酸，如赖氨酸、精氨酸和其它有机酸、无机酸所形成的盐和它们的混合物，以及其它药学可接受的衍生物。
所述的磷脂包括但不仅限于卵磷脂、大豆卵磷脂、卵黄磷脂、二月桂酰磷脂酰胆碱、二豆蔻酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰胆碱、二豆蔻酰磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰磷脂酰甘油、二豆蔻酰磷脂酸、二棕榈酰磷脂酸、二棕榈酰磷脂丝氨酸、二棕榈酰鞘磷脂、1-硬脂酸-2-棕榈酰磷脂酰胆碱或聚乙二醇-2-硬脂酰磷脂酰乙醇胺中的一种或其几种混合物。优选的为卵磷脂、大豆卵磷脂；如果选用聚乙二醇-2-硬脂酰磷脂酰乙醇胺(PEG-DSPE)还可以得到脂质体粒径更小、体内清除速率下降、半衰期延长的隐性脂质体。
所说的辅助剂包括但不仅限于蔗糖、海藻糖、乳糖、半乳糖、甘露醇、葡萄糖、山梨醇、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，赖氨酸、蛋氨酸、苏氨酸，生育酚、维生素C的一种或几种的混合，其中蔗糖、海藻糖、乳糖、半乳糖、甘露醇、葡萄糖、山梨醇、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)可起到填充、稳定、保护的作用，赖氨酸、蛋氨酸、苏氨酸，维生素E、维生素C可起到保护的作用。
所说的茶多酚包括但不仅限于从绿茶中提取的多酚，具体化学成分界定可参照文章“茶多酚预防癌症和最适宜的健康”(哈森等，美国临床营养学杂志，2000，71(增刊)1698s-1702s)。
本发明的组合物可通过任何合适的方法制备成脂质体包封的茶黄素和\或其衍生物，例如采用高压匀化法、微孔挤压法、渗析和稀释方法、超声分散法或薄膜分散法，优选薄膜分散法，具体方法可参照文章“脂质体的制备方法和研究进展”(曹宁宁等，天津理工学院学报，2003，19(1)30～36)。
本发明提供了薄膜分散法制备茶黄素脂质体，其关键为选用的磷酸盐缓冲液的pH值为4.5～6.5。
上述方法的具体步骤如下按上述比例将茶黄素、磷脂、胆固醇共同溶于有机溶剂如氯仿、乙醇、甲醇等或其混合溶剂中，过滤，减压蒸发除溶剂，干燥后，加入上述磷酸盐缓冲液，浸泡，然后在氮气流下高速搅拌或超声波处理或加压挤出，并加入含有上述比例辅助剂的磷酸盐缓冲液，使用超声波或高压匀浆泵处理可使脂质体平均粒径变小至50nm～50μm，所得混悬液在氮气保护下灌封，即得出茶黄素脂质体混悬液。
为了方便运输、使用和延长货架期，本发明还提供了茶黄素脂质体的固态形式，它是通过将上述所得的混悬液在一定条件下通过喷雾干燥或冷冻干燥得到，通过喷雾干燥可得到成均匀球形、表面光滑、流动性好的粉末，通过冷冻干燥可得到蓬松状块体，两者具有很好的亲水性，均可遇水重新分散成粒度与原溶液无差异的脂质体混悬液。
本发明脂质体组合物可通过胃肠道、静脉、腹膜内以及鼻腔、口腔等粘膜给药的方式给予哺乳动物体内或直接注射到肿瘤体中。
该组合物可以提高茶黄素的生物利用度，减少茶黄素的用药剂量，避免口服茶黄素可能引起的胃肠道不适。
上述组合物可应用于调节血脂、血糖或免疫功能方面，如制备调节血脂、血糖或免疫的药物、保健品或饮料食品等。
所述的药物可以是预防或治疗癌症、病毒感染性疾病、糖尿病或心血管疾病的药物。
具体而言，本发明的组合物可用于预防、治疗肠癌等肿瘤，血脂异常、冠心病等心血管疾病，艾滋病(AIDS)、感冒、非典型肺炎(SARS)等病毒感染性疾病等药物的制备。


图1为不同给药方式血浆中茶黄素的药时曲线图(n＝12)。
具体实施例方式
下面的实施例仅为进一步阐明本发明，而不是为了限制发明范围。
实施例1
1、TF1脂质体混悬液的制备按重量比1∶20∶2精确称取TF1、大豆卵磷脂、胆固醇共同溶于氯仿中，过滤，滤液置于梨形瓶中，在氮气流保护下旋转蒸发，减压除氯仿成薄膜，真空干燥后，加入20mmol/L、pH＝5.5的磷酸盐缓冲液，浸泡2～3小时，在氮气流下高速搅拌一段时间后，向其中缓慢滴加溶有20份辅助剂(5％甘露醇、5％聚乙烯吡咯烷酮和2％赖氨酸)的同PH值的磷酸盐缓冲液。用氮气冲洗后，封瓶后室温平衡1天，探针超声20分钟，补足缓冲液至脂质浓度为20mg/ml，脂质体混悬液用0.22μm的微孔滤膜过滤，滤液在氮气流的保护下灌装西林瓶，即得脂质体混悬液，每瓶含5mgTF1。
2、TF1脂质体冻干制剂的制备将上述装有脂质体混悬液的西林瓶置于冷冻干燥机冷冻干燥，并扎盖即得供临床使用的TF1脂质体冻于制剂，使用时只要充入适量的注射用水，室温下振摇分散即可。冷冻干燥采用的设备为东富龙科技有限公司的10m2SIP型冷冻干燥机。
3、粒度和包封率的测定取上述脂质体混悬液用光感应法测定脂质体的平均粒径为89±31.1nm，用超速离心法测包封率为85.2％。
取上述适量脂质体冻干制剂加20mmol/L、pH＝5.5的磷酸盐缓冲液溶解后，用光感应法测定脂质体的平均粒径为81±38.3nm。用超速离心法测包封率为83.5％。
实施例2TF2A脂质体混悬液的制备按重量比1∶200∶30精确称取TF2A、二月桂酰磷脂酰胆碱、胆固醇共同溶于乙醚中，过滤，滤液置于梨形瓶中，除选用pH值为4.5的磷酸盐缓冲液外，余按实施例1操作。用光感应法测定脂质体的平均粒径为100±48.3nm。用超速离心法测包封率为89.3％。
实施例3TF2B脂质体的制备按重量比1∶150∶20精确称取TF2B、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、胆固醇共同溶于乙醚中，过滤，滤液置于梨形瓶中，除选用pH值为6.5的磷酸盐缓冲液外，余按实施例1操作。用光感应法测定脂质体的平均粒径为94±36.5nm。用超速离心法测包封率为87.4％。
实施例4TF3脂质体的制备按重量比1∶100∶20∶5∶1精确称取TF3、大豆磷脂、PEG-DSPE、胆固醇、维生素C共同溶于丙酮中，过滤，滤液置于梨形瓶中，以下按实施例1操作。用光感应法测定脂质体的平均粒径为91±41.1nm。用超速离心法测包封率为82.1％。
实施例5TF2、TF3脂质体的制备按重量比1∶1∶2∶150∶10∶1精确称取TF2A、TF2B、TF3、卵黄磷脂、胆固醇、维生素E共同溶于丙酮中，过滤，滤液置于梨形瓶中，以下按实施例1操作。用光感应法测定脂质体的平均粒径为106±73.4nm。用超速离心法测包封率为76.1％。
实施例6茶多酚+茶黄素脂质体的制备按重量比20∶1∶200∶8精确称取茶多酚、茶黄素(含茶黄素TF146.8％、茶黄素-3-单没食子酸脂18.5％、茶黄素-3’-单没子酸脂13.7％、茶黄素-3，3’-双没食子酸脂20.3％)、二油酰磷脂酰胆碱、胆固醇共同溶于乙醚中，过滤，滤液置于梨形瓶中，以下按实施例1操作。用光感应法测定脂质体的平均粒径为5.1±1.0μm。用超速离心法测包封率为80.2％。
实施例7TF1赖氨酸盐脂质体的制备按重量比3∶100∶11精确称取TF1赖氨酸盐、1-硬脂酸-2-棕榈酰磷脂酰胆碱、胆固醇共同溶于乙醚中，过滤，滤液置于梨形瓶中，以下按实施例1操作。用光感应法测定脂质体的平均粒径为10.1±6.2μm。用超速离心法测包封率为78.5％。
实施例8隐形茶黄素脂质体的制备将PEG-DSPE、氢化大豆磷脂、胆固醇、维生素E和茶黄素(含茶黄素TF146.8％、茶黄素-3-单没食子酸脂18.5％、茶黄素-3’-单没子酸脂13.7％、茶黄素-3，3’-双没食子酸脂20.3％)以15∶185∶30∶0.5∶1重量比精确称重后溶于氯仿，置梨形瓶内，在氮气流保护下旋转蒸发，减压除氯仿成薄膜，真空干燥后，加入20mmol/L、pH＝5.5的磷酸盐缓冲液，浸泡2～3小时，在氮气流下高速搅拌一段时间后，向其中缓慢滴加溶有50份辅助剂(5％山梨醇、5％聚乙烯吡咯烷酮和2％赖氨酸)的同pH值的磷酸盐缓冲液。用氮气冲洗后，封瓶后室温平衡1天，探针超声20分钟，补足缓冲液至脂质浓度为20mg/ml，脂质体混悬液用0.22μm的微孔滤膜过滤，滤液在氮气流的保护下灌装西林瓶，即得脂质体混悬液，冷冻干燥后得隐形茶黄素脂质体冻干制剂。
取上述适量脂质体冻干制剂加20mmol/L、pH＝5.5的磷酸盐缓冲液溶解后，用光感应法测定脂质体的平均粒径为61±27.3nm。用超速离心法测包封率为89.7％。
实施例9饮料用茶黄素脂质体的制备将大豆磷脂、胆固醇和茶黄素(含茶黄素TF146.8％、茶黄素-3-单没食子酸脂18.5％.、茶黄素-3’-单没子酸脂13.7％、茶黄素-3，3’-双没食子酸脂20.3％)按重量比200∶30∶5精确称重后溶于氯仿，置梨形瓶内，在氮气流保护下旋转蒸发，减压除氯仿成薄膜，真空干燥后，加入20mmol/L、pH＝5.0的磷酸盐缓冲液，浸泡2～3小时，在氮气流下高速搅拌一段时间后，向其中缓慢滴加溶有30份辅助剂(2％蔗糖、5％聚乙烯吡咯烷酮和2％赖氨酸)的同pH值的磷酸盐缓冲液。用氮气冲洗后，封瓶后室温平衡1天，探针超声20分钟，补足缓冲液至脂质浓度为20mg/ml，滤液喷雾干燥后得茶黄素脂质体冻干粉末，粉末状脂质体密封于铝塑包装袋中，饮用前将脂质体粉末加于水中振摇即可。
实施例10含茶黄素22.5％的脂质体制备将大豆磷脂、胆固醇和茶叶提取物(含茶黄素TF122.5％，茶多酚55％，其中表儿茶素没食子酸酯15％)按重量比180∶10∶5精确称重后溶于氯仿，置梨形瓶内，在氮气流保护下旋转蒸发，减压除氯仿成薄膜，真空干燥后，加入20mmol/L、pH＝6.0的磷酸盐缓冲液，浸泡2～3小时，在氮气流下高速搅拌一段时间后，向其中缓慢滴加溶有25份辅助剂(5％甘露醇、8％聚乙烯吡咯烷酮和1％苏氨酸)的同pH值的磷酸盐缓冲液。用氮气冲洗后，封瓶后室温平衡1天，探针超声20分钟，补足缓冲液至脂质浓度为20mg/ml，滤液喷雾干燥后得脂质体冻干粉末。
上述实施例中所述的份数和百分比均为重量份数和重量百分比。
另外，上述实施例中茶黄素还可以是茶黄素TF1，茶黄素-3-单没食子酸脂，茶黄素-3’-单没食子酸脂或茶黄素-3，3’-双没食子酸脂的任意组合，以及它\它们与其它多酚的任意混合物；茶黄素衍生物还可选茶黄素与一些氨基酸，如赖氨酸、精氨酸和其它有机酸、无机酸所形成的盐和它们的混合物，以及其它药学可接受的衍生物；磷脂还可以选自卵磷脂、大豆卵磷脂、卵黄磷脂、二月桂酰磷脂酰胆碱、二豆蔻酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰胆碱、二豆蔻酰磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰磷脂酰甘油、二豆蔻酰磷脂酸、二棕榈酰磷脂酸、二棕榈酰磷脂丝氨酸、二棕榈酰鞘磷脂或1-硬脂酸-2-棕榈酰磷脂酰胆碱或中的一种或其几种混合物；辅助剂可为蔗糖、海藻糖、乳糖、半乳糖、甘露醇、葡萄糖、山梨醇、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，赖氨酸、蛋氨酸、苏氨酸，生育酚、维生素C的一种或几种的混合，在此就不一一列举。
本发明的脂质体组合物还可以根据上述文献采用高压匀化法、微孔挤压法、渗析和稀释方法或超声分散法等方法制备，在此也不赘述。
本发明的脂质体组合物具有调节血脂、血糖和免疫功能的作用，可用于制备这些方面的药物、保健品或饮料食品，下面举一些实验实施例来进一步说明之，但并不限于此。
实验实施例1茶黄素脂质体在小鼠体内的组织分布比较茶黄素、茶黄素脂质体和隐形茶黄素脂质体均用生理盐水稀释至茶黄素剂量0.2mg/mL，给药量5mg/kg，均平行尾静脉注射和灌胃。每种给药方式均分为肝、脾和血浆3组，随机分为每组12只昆明种小鼠，(体重20±2g，雌雄各半)。给药后于1，3，6，12，24和48h将小鼠断颈活杀，取血用肝素抗凝，离心分离血浆。分别摘取肝、脾，清除脏器周围结缔组织后，用蒸馏水洗净，滤纸吸干，精确称量，-20℃保存备用。取脏器组织标本置于匀浆器内，加入pH＝5.5磷酸盐缓冲液1mL，3000r/min匀浆1min。于组织匀浆(或血浆)内加入和乙腈-氯丁烷(1∶4)3mL，震荡混合5min后移至离心管，8000r/min离心5min。用吸管将有机相移至另一洁净试管内，60℃下用氮气吹干。残留物溶于120μL流动相，吸取20μL进样，进行RP-HPLC测定。色谱条件ODS Hypersil(250mm×4.6mm，5μm)，流动相乙腈∶磷酸盐缓冲液(75∶25)，流速2.0ml/min，检测波长380nm，室温下操作。
数据处理方法小鼠体内组织分布的血药浓度数据用中国药理学会数学药理委员会编制的3P87药动学程序进行处理。药时曲线下面积(AUC0～∞)分别由梯形法(AUC0～tz)和ctz/λ(AUCt0～∞)之和求得，并经对数转换后进行方差分析。
将茶黄素、茶黄素脂质体和隐形茶黄素脂质体口服和尾静脉给药48h，小鼠肝脾和血液的药时曲线下面积及血液/网状内皮系统比值(Blood/RES)见表1。
表1、茶黄素、茶黄素脂质体在小鼠体内的组织分布比较(剂量5mg/kg，药时曲线下面积AUC0～∞，n＝12，x±s)给药途径 肝/ 脾/ 血浆/ 血液/网状h·μg·g-1h·μg·g-1h·μg·mL-1内皮系统口服茶黄素 7.3±3.8 2.6±3.7 4.3±5.90.43口服茶黄素脂质体57±19 89±3198±21 0.67口服隐形茶黄素脂质体58±24 97±2589±36 0.57注射茶黄素 91±9 65±8 120±27 0.77注射茶黄素脂质体240±31501±43 204±12 0.28注射隐形茶黄素脂质体120±19263±32 299±30 0.78
如图1所示，血液药时曲线下面积(AUC0～48)表明，脂质体口服吸收生物利用度超过直接口服给药的20倍，普通脂质体注射给药是直接注射给药的1.7倍，隐形脂质体则是其2.5倍。从药时曲线可看出，脂质体给药可以延缓茶黄素体内驻留时间，提高的生物利用度，隐形脂质体犹为突出。
实验实施例2不同给药方式茶黄素的调脂效果将雄性SD大鼠40只，体重为100-130克，分笼饲养于恒温室内，房间的温度为22--24℃。同时，把40只大鼠随机分成4组，为空白对照组、茶黄素1组、茶黄素2组、茶黄素3组，每组10只，分别喂给相同的饲料和固定量的水，茶黄素1组、茶黄素2组、茶黄素3组三组分别给予茶黄素(灌胃，剂量4mg/kg/d)、茶黄素脂质体(灌胃，剂量茶黄素4mg/kg/d)及茶黄素脂质体(注射，剂量茶黄素4mg/kg/d)，饲料配方见表2。
表2小鼠饲料配方表空白 茶黄素 茶黄素 茶黄素组分对照组1组 2组 3组酪蛋白20％ 20％ 20％20％淀粉 47.5％ 47％ 46％45％矿物质4.5％4.5％4.5％ 4.5％维生素1.5％1.5％1.5％ 1.5％蔗糖 20％ 20％ 20％20％玉米油5％ 5％ 5％ 5％胆固醇1.0％1.0％1.0％ 1.0％口服茶黄素--- Yes --- ---口服茶黄素脂质体 --- --- Yes ---尾静脉注射茶黄素脂质体--- --- --- Yes将上述饲料连续喂养大鼠8周，末次给药前禁食12小时，给药后1小时采血测定各项血脂，具体结果见表3。
表3不同给药方式茶黄素对小鼠的血脂谱(mg/dL)的影响(x±SD)空白对照组 茶黄素1组 茶黄素2组茶黄素3组甘油三脂118.2±11.3107.1±17.1b75.4±10.8a，e67.4±10.9a，d总胆固醇134.3±12.8116.3±8.2a98.3±8.5a，d80.8±6.7a，d低密度脂蛋白胆固醇 57.9±5.1 47.7±4.2a37.6±2.7a，d29.3±2.0a，d高密度脂蛋白胆固醇 42.5±2.8 45.2±2.7c49.2±2.4b，e50.4±2.9bb，da为P＜0.01，与空白对照组比较；b为P＜0.05，与空白对照组比较；c为与空白对照组比较无显著性差异；d为P＜0.01，与TF1组比较；e为P＜0.05，与茶黄素1组比较结果显示，与空白对照组比较，茶黄素对高脂饲喂的大鼠血清总胆固醇、低密度脂蛋白和甘油三脂水平有明显下降作用；脂质体给药调脂幅度大于直接口服给药，两者之间有显著性差异；而且直接注射脂质体比口服脂质体调脂幅度要大，这两种给药方式还对HDL有升高作用。
实验实施例3 含茶黄素22.5％的脂质体与茶黄素的调脂效果比较将雄性SD大鼠30只，体重为100-130克，分笼饲养于恒温室内，房间的温度为22--24℃。同时，把30只大鼠随机分成3组，为空白对照、茶黄素22.5％的脂质体组(TF1组)、茶黄素组(TF2组)，每组10只，分别喂给相同的饲料和固定量的水，脂质体组和茶黄素组分别给予茶黄素22.5％的脂质体(灌胃，剂量相当于茶黄素0.2mg/kg/d)及茶黄素(灌胃，剂量茶黄素4mg/kg/d)，饲料配方见表4。
表4小鼠饲料配方表组分 空白对照组 TF1组TF2组酪蛋白20％ 20％ 20％淀粉 47.5％ 47％ 46％矿物质4.5％4.5％4.5％维生素1.5％1.5％1.5％
蔗糖 20％20％20％玉米油 5％ 5％ 5％胆固醇 1.0％ 1.0％ 1.0％口服茶黄素 --- --- Yes口服茶黄素22.5％的脂质体 --- Yes ---将上述饲料连续喂养大鼠8周，末次给药前禁食12小时，给药后1小时采血测定各项血脂，具体结果见表5。
表5口服茶黄素22.5％的脂质体与直接服用茶黄素对小鼠血脂谱(mg/dL)的影响(x士SD)空白组TF1组 TF2组甘油三脂118.2±11.3 100.2±20.1b107.5±14.2b总胆固醇142.4±13.4 110.5±10.2a102.3±9.5a低密度脂蛋白胆固醇60.7±8.143.1±9.7a47.5±7.2a高密度脂蛋白胆固醇38.4±3.536.1±4.7b39.1±5.6a为P＜0.01，与空白组比较；b为P＜0.05，与空白组比较结果显示，与空白对照组比较，茶黄素对高脂饲喂的大鼠血清总胆固醇、低密度脂蛋白和甘油三脂水平有明显下降作用；脂质体给药与直接口服茶黄素给药，在血脂谱上两者之间无显著性差异。
结果再次表明脂质体给药可显著改善茶黄素的生物利用度，用含茶黄素22.5％的原料制成的脂质体的调脂疗效可以达到直接给药、剂量为自己20倍的茶黄素疗效。由于含50％以下茶黄素的原料比茶黄素纯品更容易得到，将它们直接制成脂质体，在低剂量的给药的情况下就可达到高剂量纯品的疗效，具有十分现实的应用价值。
实验实施例4茶黄素不同给药方式对二甲基肼诱发小鼠大肠癌的预防和治疗作用
1、方法160只雄性小鼠随机分成8组，除对照组外，各组小鼠按20mg/kg剂量每周背侧颈部皮下注射一次二甲基肼(DMH)，共25周以诱发小鼠大肠癌，其中四个预防组同时按不同剂量的茶黄素或茶黄素脂质体灌胃给药，两个治疗组于诱癌第18周时开始灌胃给药，动物每周称重1次以调整给药剂量。分别于实验第10、12、14、16周末每组各处死解剖1只小鼠，并于25周末处死全部剩余小鼠，取肛门以上8cm肠段沿结肠纵轴剖开，洗净，称肠重，并仔细观察记录有无肿瘤发生及发生数目、大小和位置，计算肿瘤发生率。将大肠标本置于10％福尔马林溶液中固定，以“席卷法”石蜡包埋，切片，HE染色，行常规病理学检查。红细胞SOD活力测定采用邻苯三酚自氧化法进行。全血GSH-Px活力测定采用DTNB直接法。大肠粘膜增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)检测采用免疫组化方法(S-P法)检测，步骤按试剂说明书进行，以PCNA标记指数(PCNA-LI)作为评价指标，PCNA-LI＝(阳性细胞数/1000)×100％。实验方法参见“二甲基肼诱发小鼠大肠癌的实验研究”(耿宝琴等，浙江医科大学学报，1982；11(6)269)以及“儿茶素抑制二甲基肼诱发小鼠大肠癌的实验研究”(银平章等，营养学报，1994，16(2)149～154)。
2、结果2.1一般情况 实验期间共死亡小鼠18只，其中DMH染毒组小鼠16只，绝大多数发生在诱癌8周内(9/12)，死前动物消瘦，解剖未发现特殊病变和肿瘤，可能系注射DMH的毒性引起。
茶黄素对诱癌小鼠大肠肠重、肿瘤发生数及发生率的影响除空白对照组粘膜完整光滑，未发现大肠肿瘤外，各DMH染毒组小鼠肠粘膜均有不同程度的增厚，皱襞紊乱。诱发肿瘤均为隆起型，主要分布在距肛门以上8cm肠段内，尤以5cm处较集中，肿瘤发生数在0～19个范围内不等。肿瘤大小不一，多数直径约1～2mm，DMH模型组肿瘤直径相对较大。各DMH染毒组之间肠重无明显差异，预防组3、4和治疗组2肿瘤发生数和发生率均明显少于DMH模型组，而预防组1、2未见与DMH模型组有显著性差异，说明茶黄素脂质体对预防或抑制肿瘤有显著效果，并提示出量效关系。结果见表6表6不同茶黄素剂型对DMH诱癌小鼠肠重、肿瘤数和肿瘤发生率的影响(x±s)组别肠重(g) 肿瘤数(个) 肿瘤发生率(％)对照组 0.41士0.100 0(0/13)模型组(DMH) 0.56±0.12##9.33±4.14#100(12/12)##预防组1(茶黄素5mg/kg) 0.47±0.095.08±5.29 83.3(10/12)预防组2(茶黄素10mg/kg) 0.48±0.086.14±5.72 85.7(12/14)预防组3(TF-脂质体5mg/kg)0.50±0.153.09±3.78*63.6(7/11)*预防组4(TF-脂质体10mg/kg) 0.49±0.082.67±2.33**41.7(5/12)**治疗组1(茶黄素5mg/kg) 0.48±0.105.57±4.21 100(11/11)治疗组2(TF-脂质体5mg/kg)0.50±0.093.79±2.10*100(12/12)与DMH模型组比较*P＜0.05，**P＜0.01与空白对照组比较#P＜0.05，##P＜0.012.3病理学检查 10周末处死的1只DMH模型组小鼠大肠病理已出现I级不典型增生，至14周时除空白对照组外各组均已出现I-III级不典型增生。诱癌第18周时首次发现有原位癌，至25周末各染毒组小鼠大多已诱发大肠癌。诱发的大肠癌在组织学上均为高分化腺癌，尤以乳头状腺癌多见，偶见粘液腺癌和管状腺癌。诱发肿瘤绝大多数为粘膜内癌，少数已进展为早期浸润癌(以突破基底膜为界)，突破粘膜肌层或侵入粘膜下层。其中DMH模型组浸润癌发生率为50％，明显高于其它组，直接服用茶黄素浸润癌数虽绝对值小于模型组，但两者之间无显著性差异，而脂质体给药浸润癌数减少，并存在统计学意义，结果提示茶黄素有延缓肿瘤发生或减慢肿瘤进展的作用，结果见表7。
表7不同茶黄素剂型对DMH诱发小鼠大肠癌的影响组别 鼠数大肠癌数(％) 浸润癌数(％)对照组 13 0(0.0) 0(0.0)模型组(DMH) 12 12(100.0)##6(50.0)##预防组1(茶黄素5mg/kg)12 10(83.3.0) 1(8.3)预防组2(茶黄素10mg/kg) 14 12(85.7) 4(33.3)预防组3(TF-脂质体5mg/kg) 11 7(63.6)*1(9.1)*预防组4(TF-脂质体10mg/kg)12 5(41.7)*1(8.4)*治疗组1(茶黄素5mg/kg)11 11(100)2(18.2)*治疗组2(TF-脂质体5mg/kg) 12 12(100)2(16.7)*与DMH模型组比较*P＜0.05，**P＜0.01与空白对照组比较#P＜0.05，##P＜0.012.4不同茶黄素剂型对诱癌小鼠红细胞SOD活性及全血GSH-Px活性的影响与空白对照组比较，DMH模型组小鼠红细胞SOD活性及全血GSH-Px活性显著下降，而茶黄素用药各组其酶活力较DMH模型组则均明显升高，预防组1、2未能达到正常水平，而预防组3、4及治疗组1、2达到正常水平，结果表示茶黄素对诱癌小鼠红细胞SOD活性及全血GSH-Px活性具有保护作用，脂质体给药效果更好，具体见表8。
表8不同茶黄素剂型对DMH诱癌小鼠红细胞SOD活性及全血GSH-Px活性的影响(x±s)红细胞SOD活性全血GSH-Px活性组别鼠数(U/g*Hb) (U/ml)对照组 133709±400 46.60±9.36模型组(DMH) 122650±589##30.91±5.56##
预防组1(茶黄素5mg/kg) 12 3194士397*，#39.93±8.82*，#预防组2(茶黄素10mg/kg) 14 3228士423**，#41.22士6.24**，#预防组3(TF-脂质体5mg/kg) 11 3847士386**47.20士7.51**预防组4(TF-脂质体10mg/kg) 12 3973士547**49.41士6.65**治疗组1(茶黄素5mg/kg) 11 3068士454**40.31士7.57**治疗组2(TF-脂质体5mg/kg) 12 3112士501**37.01士6.48**与DMH模型组比较*P＜0.05，**P＜0.01与空白对照组比较#P＜0.05，##P＜0.012.5不同茶黄素剂型对诱癌小鼠肠粘膜PCNA表达水平的影响2.5.1染色结果PCNA阳性染色定性于肿瘤细胞核内的棕黄色颗粒。正常粘膜PCNA阳性细胞分布稀疏，而癌组织中的阳性细胞分布则紊乱无规律，多为强阳性的片状分布。
2.5.2 PCNA-LI空白对照组各小鼠肠粘膜组织PCNA-LI均小于25％，低于其它各组，预防组1、2与DMH模型组之间无显著性差异，预防组3、4和治疗组1、2的PCNA-LI值高于空白对照组，但低于DMH模型组，两者间存在显著性差异，结果进一步说明茶黄素脂质体对DMH诱发小鼠大肠癌均有预防和治疗作用，而直接服用茶黄素未能观察到对肿瘤的预防作用，结果见表9。
表9不同茶黄素剂型对诱癌小鼠大肠组织PCNA-LI的影响(x±s)组别鼠数PCNA-LI(％)对照组13 17.54士3.48模型组(DMH) 12 49.58±12.84##预防组1(茶黄素5mg/kg)12 42.58士6.89##预防组2(茶黄素10mg/kg) 14 48.14士8.07##
预防组3(TF-脂质体5mg/kg)11 26.55±8.29**，#预防组4(TF-脂质体10mg/kg) 12 21.75±9.83**，#治疗组1(茶黄素5mg/kg) 11 42.63±8.96##治疗组2(TF-脂质体5mg/kg)12 32.26±6.13**，#与DMH模型组比较*P＜0.05，**P＜0.01与空白对照组比较#P＜0.05，##P＜0.01本实验结果显示茶黄素脂质体对DMH诱发小鼠大肠癌均有预防和治疗作用，初步体现出一定的量效关系。
DMH是一间接致癌剂，进入体内后可进一步被酶解或自发分解，产生醛、羟基离子及活性甲基化形式的重氮化合物，使大肠粘膜上皮细胞核DNA分子中鸟嘌呤甲基化，从而改变DNA分子结构，引起细胞癌变。而细胞内SOD和GSH-Px等酶系统可有效清除自由基，起到防治肿瘤的作用。本实验发现茶黄素直接给药或脂质体给药均能显著提高诱癌小鼠红细胞SOD活力和血GSH-Px活力，但脂质体给药效果更加显著，而且脂质体给药才显现出茶黄素的预防肿瘤的作用。
PCNA是一种33～36KD的核蛋白(多肽)，系DNA多聚酶δ的辅助蛋白，是细胞DNA合成期必不可少的因子。PCNA的出现明显与细胞增殖周期有关，并受生长因子的调节。在静止期细胞其含量很少；G1晚期开始增加，S期达到最高峰，G2期和M期则明显下降，说明其含量的变化与DNA合成过程一致。因此认为它能有效反映细胞增殖功能，是评估肿瘤恶变的一个重要指标。本研究结果表明茶黄素脂质体在DMH诱癌小鼠大肠癌的发生过程中均可明显抑制肠粘膜细胞的增殖活性，减少粘膜细胞发生突变的机率，从而降低大肠癌的发生率，延缓肿瘤的进展。实验中还发现，茶黄素脂质体具有治疗作用。
权利要求
1.一种含有茶黄素及其衍生物的组合物，其特征在于该组合物是含有下列重量份原料的脂质体茶黄素和\或其衍生物1～5份，磷脂20～200份，胆固醇2～30份和辅助剂0.5～50份。
2.如权利要求1所述的组合物，其特征在于该茶黄素为含有1’，2’-二羟基-3，4-苯骈酚酮结构的一类化合物。
3.如权利要求2所述的组合物，其特征在于该茶黄素为茶黄素TF1、茶黄素-3-单没食子酸脂、茶黄素-3’-单没食子酸脂或茶黄素-3，3’-双没食子酸脂的一种或它们的任意组合。
4.如权利要求1所述的组合物，其特征在于所述的茶黄素衍生物为茶黄素的盐或其混合物。
5.如权利要求4所述的组合物，其特征在于所述的茶黄素的盐为含有1’，2’-二羟基-3，4-苯骈酚酮结构的一类化合物的盐。
6.如权利要求5所述的组合物，其特征在于所述的茶黄素的盐为茶黄素TF1、茶黄素-3-单没食子酸脂、茶黄素-3’-单没食子酸脂或茶黄素-3，3’-双没食子酸脂的盐。
7.如权利要求4-6任一权利要求所述的组合物，其特征在于所述的茶黄素的盐为茶黄素与有机酸或无机酸所形成的盐。
8.如权利要求7所述的组合物，其特征在于所述的有机酸为氨基酸。
9.如权利要求8所述的组合物，其特征在于所述的氨基酸为赖氨酸或精氨酸。
10.如权利要求1所述的组合物，其特征在于所述的磷脂为卵磷脂、大豆卵磷脂、卵黄磷脂、二月桂酰磷脂酰胆碱、二豆蔻酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰胆碱、二豆蔻酰磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰磷脂酰甘油、二豆蔻酰磷脂酸、二棕榈酰磷脂酸、二棕榈酰磷脂丝氨酸、二棕榈酰鞘磷脂、1-硬脂酸-2-棕榈酰磷脂酰胆碱或聚乙二醇-2-硬脂酰磷脂酰乙醇胺中的一种或其几种的混合物。
11.如权利要求10所述的组合物，其特征在于所述的磷脂为卵磷脂、大豆卵磷脂或聚乙二醇-2-硬脂酰磷脂酰乙醇胺。
12.如权利要求1所述的组合物，其特征在于所述的辅助剂为蔗糖、海藻糖、乳糖、半乳糖、甘露醇、葡萄糖、山梨醇、聚乙烯吡咯烷酮，赖氨酸、蛋氨酸、苏氨酸，生育酚、维生素C的一种或其几种的混合物。
13.如权利要求1所述的组合物，其特征在于该组合物还含有0-20重量份的茶多酚。
14.如权利要求1-6和8-13任一权利要求所述的组合物，其特征在于该组合物的平均粒径为50nm-50μm。
15.如权利要求1所述的组合物的制备方法，其特征在于该方法采用高压匀化法、微孔挤压法、渗析和稀释方法、超声分散法或薄膜分散法。
16.如权利要求15所述的方法，其特征在于该方法采用薄膜分散法。
17.如权利要求16所述的方法，其特征在于该方法中所用的磷酸盐缓冲液的pH值为4.5～6.5。
18.如权利要求1所述的组合物在调节血脂、血糖或免疫功能方面的应用。
19.如权利要求18所述的应用，其特征在于该应用是指制备调节血脂、血糖或免疫的药物、保健品或食品。
20.如权利要求19所述的应用，其特征在于所述的药物是指预防或治疗癌症、病毒感染性疾病、糖尿病或心血管疾病的药物。
21.如权利要求20所述的应用，其特征在于所述预防或治疗病毒感染性疾病的药物是指预防或治疗感冒、艾滋病或SARS的药物。
22.如权利要求20所述的应用，其特征在于所述预防或治疗心血管疾病的药物是指预防或治疗血脂异常或冠心病的药物。
23.如权利要求20所述的应用，其特征在于所述预防或治疗癌症的药物是指预防或治疗肠癌的药物。
全文摘要
一种含有茶黄素及其衍生物的组合物，该组合物是含有下列重量份原料的脂质体茶黄素和\或其衍生物1～5份，磷脂20～200份，胆固醇2～30份和辅助剂0.5～50份；本发明还公开了上述组合物的制备方法；本发明提供的组合物可以提高茶黄素的生物利用度，减少茶黄素的用药剂量，避免口服茶黄素可能引起的胃肠道不适，可将其用于保健食品或饮料中，起到预防癌症以及各种心、脑血管疾病等作用，还可作为药物治疗癌症、艾滋病、糖尿病等疾病，具有经济价值和社会效益。
文档编号A61P31/12GK1618425SQ20031010871
公开日2005年5月25日 申请日期2003年11月19日 优先权日2003年11月19日
发明者赵剑, 翟志慧, 周睿 申请人:上海科宝生物技术有限公司