淋巴毒素衍生物的新用途的制作方法
本发明涉及淋巴毒素衍生物lt008的新用途，属于医药新用途技术领域。
背景技术：
本发明所说的核辐射指原子核从一种结构或一种能量状态转变为另一种结构或另一种能量状态过程中所释放出来的微观粒子流。由于目前环境污染、能源紧缺，核能作为一种高效清洁的能源，在全球被广泛运用。但是，核泄露导致的安全隐患却对人类的生存产生巨大的影响。核辐射可导致急性、慢性的组织损伤甚至严重的器官功能障碍，尤其对增殖更新迅速的细胞构成的组织造成的损伤更为严重。辐射后病人死亡的主要原因是由于骨髓抑制导致的造血功能障碍以及外周血白细胞下降，继而使免疫功能损伤，导致继发性感染。因此，保护和恢复骨髓功能是关系到辐射损伤患者预后的关键因素之一，但目前对核辐射导致的骨髓损伤尚缺乏有效的防护手段和治疗方法。
美国genentech公司早在1996年就发现野生型淋巴毒素α（lymphotoxinα，ltα）对核辐射造成的小鼠骨髓损伤具有保护作用，但由于在随后的临床前动物试验中发现野生型ltα可以引起明显的不良反应，如严重的毛细血管渗漏、低血压和寒战发热等，从而使ltα的应用研究未能深入进行。
技术实现要素：
本发明提供了淋巴毒素衍生物lt008（别名lta-55）的新用途，特别是在制备治疗辐射所致的急性、慢性组织损伤甚至严重的器官功能障碍的药物中的应用。
本发明在野生型ltα的基础上，最初从降低野生型ltα的毒副作用的角度出发，开发n端缺失27个氨基酸残基的ltα衍生物（ltα-27）用于联合化疗。临床前动物试验表明，ltα-27联合化疗药物能够发挥明显的协同杀伤上皮来源肿瘤的作用，而不会诱导骨髓来源细胞凋亡的发生，反而会保护骨髓来源细胞对抗化疗药物的细胞毒作用。但ltα-27在临床i期阶段仍有70%的受试者出现比较严重的寒战发热，限制了它的进一步开发，然而令人意外的发现是临床i期联合使用ltα-27的化疗病人，其血小板、淋巴细胞和中性粒细胞下降幅度明显低于单独使用化疗药物的患者，即ltα-27显现出明显的骨髓/造血细胞保护作用。进一步的机制研究发现ltα通过与肿瘤坏死因子受体1(tumornecrosisfactorreceptor1,tnfr1)和tnfr2结合，启动下游信号通路发挥其生物学作用，其中毒副作用主要与tnfr2结合有关。因此在此研究基础上，通过计算机辅助设计和实验筛选，得到与tnfr1特异性结合，但亲和力适中的淋巴毒素衍生物lt008。初步的药效学结果显示：lt008在猕猴上能够使血小板和淋巴细胞上升，对抗化疗药物的骨髓损伤作用，在小鼠上能够对抗核辐射骨髓损伤使生存率显著增加。为开拓淋巴毒素衍生物的新用途提供了依据。具体生物学实验研究结论包括以下方面：
（1）lt008对核辐射导致的小鼠损伤有保护作用：lt008能使小鼠的生存率显著增加；能够促进血象的回升；促进骨髓造血功能的恢复；增加脾脏的髓外造血；
（2）lt008能保护核辐射导致的thp-1细胞的损伤：lt008能减少核辐射诱导的细胞凋亡和细胞焦亡；减少核辐射导致的ros的产生；逆转核辐射导致的细胞周期的阻滞，促进细胞增殖；
（3）lt008在thp-1细胞和小鼠体内均能激活nlrp3炎症小体，lt008在小鼠骨髓还能促进p52核转位，激活nf-κb；
（4）lt008对三种基因的敲除小鼠（nlrp3-/-、asc-/-和caspase-1-/-）核辐射后导致的损伤保护作用下降,表明lt008对核辐射导致的小鼠损伤的保护作用与nlrp3炎症小体有关；
（5）lt008能在小鼠脾脏中促进凋亡抑制因子bcl-xl的表达，该作用可能与血小板的再生，进而机体重新启动免疫有关；
因此，lt008在防治核辐射性疾病，特别是治疗辐射所致的急性、慢性组织损伤甚至严重的器官功能障碍疾病方面具有良好的效果，可制备成应用于此方面的新药。
附图说明
图1为野生型小鼠辐照后生存率曲线图：a:雌性小鼠的生存率曲线图；b:雄性小鼠的生存率曲线图；c:雌、雄小鼠合并统计后的生存率曲线图；
图2为野生型小鼠辐照后体重变化图：a:雌性小鼠体重变化图；b:雄性小鼠体重变化图；c:雌、雄小鼠合并统计后体重变化图；
图3为lt008对wt小鼠rbc影响曲线图：a:野生型雌性小鼠rbc的影响曲线图；b:野生型雄性小鼠rbc的影响曲线图；c:野生型雌、雄小鼠合并统计后rbc的影响曲线图；
图4为lt008对wt辐照小鼠hgb影响曲线图：a:野生型雌性小鼠hgb的影响曲线图；b:野生型雄性小鼠hgb的影响曲线图；c:野生型雌、雄小鼠合并统计后hgb的影响曲线图；
图5为lt008对wt辐照小鼠retic%影响曲线图：a:野生型雌性小鼠retic%的影响曲线图；b:野生型雄性小鼠retic%的影响曲线图；c:野生型雌、雄小鼠合并统计后retic%的影响曲线图；
图6为lt008对辐照小鼠plt影响曲线图：a:野生型雌性小鼠的影响曲线图；b:野生型雄性小鼠的影响曲线图；c:野生型雌、雄小鼠合并统计后的影响曲线图；
图7为lt008对小鼠wbc影响曲线图：a:野生型雌性小鼠的影响曲线图；b:野生型雄性小鼠的影响曲线图；c:野生型雌、雄小鼠合并统计后的影响曲线图；
图8为lt008对小鼠lymph%影响曲线图：a:野生型雌性小鼠的影响曲线图；b:野生型雄性小鼠的影响曲线图；c:野生型雌、雄小鼠合并统计后的影响曲线图；
图9为lt008对小鼠neut%影响曲线图：a:野生型雌性小鼠的影响曲线图；b:野生型雄性小鼠的影响曲线图；c:野生型雌、雄小鼠合并统计后的影响曲线图；
图10.lt008对辐照后wt小鼠骨髓损伤的保护作用（骨髓涂片）w3：野生型c57bl/6小鼠pbs对照组；w4：野生型c57bl/6小鼠lt008组；d0~d28：辐照当天为d0，辐照后24小时为d1，以此类推；
图11.lt008对wt小鼠辐照后骨髓病理组织学的影响：w3：野生型c57bl/6小鼠pbs对照组；w4：野生型c57bl/6小鼠lt008组；d0~d28：辐照当天为d0，辐照后24小时为d1，以此类推；
图12.lt008对wt小鼠辐射后脾脏髓外造血的影响：w3：野生型c57bl/6小鼠pbs对照组；w4：野生型c57bl/6小鼠lt008组；d0~d28：辐照当天为d0，辐照后24小时为d1，以此类推；
图13.lt008对thp-1细胞增殖的影响（a）及对辐照致细胞损伤后保护作用观察（b）；
图14.lt008对辐射后thp-1细胞的细胞周期的影响；
图15.在辐射情况下lt008对thp-1细胞内ros产生的影响；
图16.lt008对辐射导致thp-1细胞焦亡的影响；
图17.lt008对nlrp3炎症小体相关基因mrna表达的影响；
图18.lt008对thp-1细胞上清分泌il-1β的影响；
图19.电镜下观察lt008和/或核辐射对thp-1细胞炎症小体的影响a：对照组；b：10μg/mllt008处理细胞8小时；c：10gy辐射后即刻；d：lt00810μg/ml处理细胞8小时+10gy辐射后即刻；
图20.野生小鼠脾脏免疫荧光染色效果图(il-1β)；
图21.lt008促进辐照后小鼠脾脏il-1β和il-18的表达，a:lt008在辐射后d3~d5天促进野生型小鼠脾脏il-1β和il-18的蛋白表达；b:lt008在辐射后d3~d5天对nlrp3-/-小鼠脾脏il-1β和il-18的蛋白表达无明显作用；
图22.lt008对三种基因敲除小鼠辐照后生存率影响曲线图a:lt008对雌性nlrp3-/-小鼠辐照后生存率影响曲线图；b:lt008对雄性asc-/-小鼠辐照后生存率影响曲线图；c:lt008对caspase-1-/-小鼠辐照后生存率影响曲线图；d:lt008对野生型和三种基因敲除小鼠辐照后生存率影响曲线图；
图23.lt008对对三种基因敲除小鼠辐照后体重影响曲线图a:lt008对雌性nlrp3-/-小鼠辐照后体重影响曲线图；b:lt008对雄性asc-/-小鼠辐照后体重影响曲线图；c:lt008对雌性雌、雄小鼠合并统计后caspase-1-/-小鼠辐照后体重影响曲线图；
图24.野生型小鼠胸骨免疫荧光染色（nf-κb和nlrp3）；
图25.lt008促进小鼠脾脏bcl-xl的表达a:lt008在辐射后d7~d18天促进野生型小鼠脾脏bcl-xl的蛋白表达；b:lt008在辐射后d7~d18天促进nlrp3-/-小鼠脾脏bcl-xl的蛋白表达，但是幅度低于野生型。
具体实施方式
以下所列实施例，仅为帮助本领域技术人员更全面理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
实施例1lt008的制备
根据公开号为cn101084238b专利文献实施例1的工艺来制备，其氨基酸序列（seqidno：1）为：
mhstlkpaahligdpskqnsllwrantdraflqdgfslsnnsllvptsgiyfvysqvvfsgkayspkatssplylahevqlfsseypfhvpllssqkmvypglqepwlhsmyhgaafqltqgdqlsthtdgiphlvlspstvffgafal。
实施例2lt008在体内能促进野生型c57bl/6小鼠核辐射导致的损伤的恢复
2.1研究方法
野生c57bl/6小鼠购入后在spf动物房检疫饲养3周，在分组前用bs124天平称量体重后，采用耳标法进行编号标记，并根据体重随机分组。分为pbs对照组（w1）和lt008组（w2），每组20只，雌雄各半，用于生存率的测定。另外用pbs对照组（w3）和lt008组（w4），每组60只，雌雄各半，用于血象、骨髓细胞学、骨髓病理学以及相关机制的研究。
所有lt组小鼠在辐照前两天和辐照当天，75%酒精消毒后，连续三天尾静脉注射给予250µg/kglt008。给药浓度25µg/ml，给药体积10ml/kg。对照组给予10ml/kg的pbs。所有组别的小鼠在第二军医大学海医系辐射中心进行辐照，动物整体暴露于60co-γ辐射下，按照1.63gy/min的辐射率进行辐照，整体辐射量达到9.5gy，进行生存率研究和体重监测，1.63gy/min的辐射率进行辐照，整体辐射量达到9.0gy，用于血象、骨髓细胞学、骨髓病理学以及相关机制的研究。
2.2研究结果
一般情况：对照组小鼠（w1）辐照当天就出现活动明显减少，摄食及饮水也减少，但给予lt008的小鼠（w2组）辐照当天活动如常，摄食及饮水均无明显减少，辐照后第二天（d1）w1组所有小鼠均静卧，活动进一步减少，w2组小鼠活动开始略减少，辐照后第三天（d3），w1组小鼠毛发开始蓬松，到第五天（d5），w1组小鼠几乎全部出现毛发蓬松，躯体松软无力，而w2组小鼠一直没有明显的毛发蓬松以及肌肉无张力现象。w1组小鼠第八天（d8）开始出现死亡，死亡集中发生在d8~d9天，至d12天，w1组小鼠全部死亡。w2组小鼠，雌性小鼠在d14死亡两只，雄性小鼠d18死亡一只，其余小鼠均存活至观察期结束（d28天）。
生存率曲线显示：lt008组小鼠的生存率显著高于pbs对照组，在雌性小鼠、雄性小鼠分别统计以及雌雄小鼠一起统计时的结果是一致的（图1）。
（3）体重监测结果显示：lt008对辐射后小鼠的体重恢复是有促进作用的（图2）。
（4）lt008对野生型c57bl/6小鼠核辐射后血象恢复有促进作用：9.0gy辐照后，野生型pbs组（w3）的红细胞（rbc）、血红蛋白（hgb）的数目和红细胞比容（hct）在辐射后均迅速降低，且无好转趋势，野生型lt008250µg/kg组（w4）小鼠在辐射初期上述指标均有降低，在d10到达最低点，之后开始回升，在d21左右基本恢复正常。该结果表明lt008对野生小鼠核辐射后造血功能的损伤有保护作用（图3至图5）。
网织红细胞（retic）是尚未完全成熟的红细胞，在周围血液中的数值可反映骨髓红细胞的生成功能，从原始红细胞阶段增殖到晚幼红细胞阶段共分裂3~4次，约需72小时，红细胞数由一个变为8~16个。晚幼红细胞阶段以后的细胞不再分裂，发育过程中核被排出而成为网织红细胞。从晚幼红细胞发育到成熟红细胞约需48小时。在正常情况下骨髓中有核红细胞并不释放至血循环，只有网织红细胞和成熟红细胞才释入血中，检查末梢血中网织红细胞数，可以推知骨髓产生红细胞的能力。因此，网织红细胞是反映骨髓红系造血功能以及判断贫血和相关疾病疗效的重要指标。因此我们进一步检测了retic的改变，结果如图5所示，辐射后d1，w3和w4组小鼠的网织红细胞均开始降低，最低时均几乎降低至0，但是w4组小鼠的网织红细胞降到谷底后，于d10开始逐渐代偿性升高，比例大幅度上升至18%-30%，至d28左右基本恢复正常。该结果显示lt008对红细胞的生长有很强的促进作用。
血小板寿命约7~14天，每天约更新总量的1/10，衰老的血小板大多在脾脏中被清除。电离辐射、烷化剂、抗代谢剂、细胞毒性制剂等理化因素可抑制骨髓，这些物质常被用来治疗恶性肿瘤，或者直接损害骨髓细胞，或者引发免疫反应，甚至使骨髓出现弥漫性损伤，导致全血细胞减少。有少数患者的巨核细胞对辐射较敏感，可只表现为血小板和巨核细胞减少。因此我们也检测了血小板的改变，结果如图6所示，与w3组相比，w4组（lt008组）小鼠辐射前plt略低于w3组（pbs对照组），在辐射后d1，w3组较辐射前有显著升高以外，w4组plt迅速下降，两组均在d5降至最低值，随后w4组小鼠的plt有所恢复，在d21左右基本恢复正常，而pbs组的小鼠无恢复，直至最后死亡。
对野生小鼠血象白细胞系监测的结果显示：对野生型小鼠，lt008组（w4组）和pbs对照组（w3组）白细胞总数（wbc）在辐射后d1均开始急速下降，d3降至最低，w4组小鼠在d14开始有恢复的趋势，存活小鼠在d21~d28基本恢复正常，而w3组小鼠的wbc持续至观察终点（动物死亡）未有明显恢复趋势（图7）。小鼠lymph%和neut%的检测发现lt008组和pbs辐射对照组之间未见明显的趋势性差异，这有可能和辐射后小鼠白细胞总数下降至极低值以及个体之间的差异而导致（图8和9）。
（5）lt008对野生型c57bl/6小鼠核辐射后的骨髓恢复有促进作用
用同样的9.0gy60co-γ的辐照剂量作用于野生型小鼠，lt008组（w4组）辐射前连续三天给予250μg/kg剂量尾静脉注射，pbs对照组（w3组）给予10ml/kg的容积静脉注射pbs。在不同的时间点脱颈椎处死小鼠后，取下肢股骨做骨髓涂片，进行骨髓细胞学检查，取胸骨做病理切片，行病理组织学检查。结果显示辐射前（d0），w3组和w4的骨髓情况接近，辐射后d1（24h），w3组损伤情况较w4组轻，但是d3天开始，骨髓损伤程度两者接近，d7开始，w4组骨髓损伤开始有明显的好转，骨髓有核细胞增生较活跃，但是w3组骨髓有核细胞增生仍旧低下，直至d14开始，w3组存活小鼠的骨髓有核细胞才显示出增生较活跃，而此时w4组的骨髓各系的细胞形态、比例以及染色均呈现出恢复趋势。至d18，w4组各系细胞形态结构基本正常，而w3组则仍显示出骨髓有核细胞增生欠活跃，仅可见少量有核红细胞。d21，w4组骨髓完全恢复正常，而w3组动物均死亡，未采集到d21天的骨髓。从骨髓涂片结果显示，w4组较w3有明显的保护作用（图10）。
野生型小鼠骨髓切片的病理结果显示：在辐射的作用下，w3组小鼠的骨髓切片显示从d1开始，骨髓的增生开始降低，至d3极度降低，该情况一直持续至d18，并且骨髓的淤血、出血和水肿程度加深。在lt008作用下，w4组野生型小鼠的骨髓切片显示在d1仍然增生活跃，d3开始，骨髓增生极度降低，d10骨髓增生降低程度缓解，d14骨髓增生开始恢复，局灶性造血细胞恢复，而至d18，骨髓相恢复正常，骨髓增生增强。由于w3组动物在d18后全部死亡，故未采集到d21的骨髓结果。以上结果显示，在lt008的作用下，辐照后的野生型小鼠的骨髓造血功能恢复较pbs对照组有明显的增强（图11）。
（6）、lt008对野生型c57bl/6小鼠核辐射后脾脏的髓外造血有促进作用
用同样的9.0gy60co-γ的辐照剂量作用于野生型小鼠，lt008组（w4组）辐射前连续三天给予250μg/kg剂量尾静脉注射，pbs对照组（w3组）给予10ml/kg的容积静脉注射pbs。在不同的时间点脱颈椎处死小鼠后，取脾脏做病理切片，行病理组织学检查。脾脏的病理组织学结果表明：野生型小鼠lt008组（w4）和pbs组（w3）均在辐照后d1就出现白髓淋巴细胞减少，从d7开始，w4组开始出现淋巴样增生，d10开始出现髓外造血，说明在lt008的作用下，由于骨髓功能的抑制，脾脏开始代偿性出现髓外造血，以弥补机体造血能力的不足，而pbs组仅出现淋巴样增生，未出现明显的髓外造血现象（图12）。以上结果说明，lt008对辐射后小鼠的脾脏髓外造血功能有促进作用。
以上研究结果表明，lt008能通过促进辐照后的野生型小鼠的一般状况和体重的恢复，增加辐照后小鼠的生存率，促进辐照小鼠外周血象、骨髓造血功能的恢复以及增加其脾外造血功能进而弥补机体因辐照造成的骨髓造血功能的不足来发挥辐射保护作用。
实施例3lt008体外对核辐射导致人单核细胞thp-1损伤的保护作用
3.1lt008能促进thp-1细胞的增殖并促进辐照下thp-1细胞的存活
（1）方法：不同浓度的lt008（0、0.1、1、10和50μg/ml）处理thp-1细胞不同的时间（0、1、4、8、24、48和72小时）后进行细胞计数来做细胞的增殖曲线；用上述不同浓度的lt008作用于细胞后即刻进行总量6gy60co-γ的辐照（1.63gy/min），0、1、4、8、24、48、72h进行细胞计数，做细胞增殖曲线。结果见图13。
（2）试验结果：结果如图13a所示，与对照组相比，0~10μg/mllt008处理细胞不同时间细胞数没有明显改变，但50μg/mllt008处理细胞4h后thp-1细胞数目明显开始增多，约为对照的1.26倍（p<0.05），72小时约为对照的1.55倍（p<0.05），以上结果表明在50μg/mllt008对thp-1细胞的增殖有促进作用。进行总量6gy60co-γ的辐照（1.63gy/min）后，0、1、4、8、24、48、72h进行细胞计数，结果如图13b所示，1μg/ml和10μg/mllt008处理组在72h检测点细胞数明显多于对照组（p<0.05）。而50μg/mllt008处理组4小时开始细胞数就明显多于对照组，一直到观察的72小时均高于对照组。以上结果表明在体外，lt008对辐射导致的thp-1细胞损伤有一定的保护作用。
3.2lt008能够逆转辐照导致的thp-1细胞g2期的阻滞
（1）方法：不同浓度的lt008（0、1、10和50μg/ml）处理thp-1细胞8小时，除对照组细胞外，所有细胞用6gy60co-γ的辐射，分别在0min、5min、1h、4h、8h、24h、48h、72h，1000rpm离心5分钟收集细胞，流式细胞仪进行细胞周期检测。
（2）试验结果：结果如图14所示，辐射后8小时，与对照组相比，不同浓度的lt008处理的细胞g0/g1期细胞开始降低，g2期开始增加，24小时时g0/g1期降低十分显著（从对照的60%降低到20%，p<0.05），g2期显著增加（从对照的16%增加至48%左右，p<0.05），但在48小时时，50μg/mllt008处理组细胞与0μg/mllt008处理组相比g0/g1期比例显著增加，基本恢复到无辐照时候的比例（p<0.05），g2期显著减少至无辐照时候的比例（p<0.05）。
以上研究结果表明：辐照后细胞发生g2期阻滞，50μg/mllt008可以帮助细胞在48小时可完全逆转g2期阻滞，恢复正常细胞周期。
3.3lt008对辐照后细胞内ros的影响
（1）方法：用50μg/ml的lt008作用于thp-1细胞，在总量10gy60co-γ
（1.63gy/min）的辐照后5min、24h、48h、72h用流式细胞仪检测细胞内的ros。
（2）试验结果：结果如图15所示，在单纯辐照的情况下，随着核辐射时间的增加，ros逐渐增加，72h时为对照的5.6倍（p<0.01），50μg/ml的lt008处理细胞可以降低10gy60co-γ的辐照后细胞内72hros的含量（p<0.05）。
3.4lt008对核辐射导致的细胞焦亡的影响
（1）方法：分别用pbs（0μg/ml）或10μg/mllt008处理thp-1细胞8小时后，10gy60co-γ的辐照（ir组）或不辐照（con组），分别在即刻、24h、48h和72h1000rpm离心5分钟收集细胞，流式细胞仪检测细胞焦亡。
（2）试验结果：结果如图16所示，细胞辐照24小时后，细胞焦亡明显增加（p<0.01），10μg/mllt008组细胞在辐射后24h、48h以及72h和单纯辐射组相比，细胞焦率均显著降低（p<0.05，p<0.01），该结果显示：lt008能显著降低辐射后thp-1细胞的焦亡比率，lt008对辐射后的thp-1细胞有明显的保护作用。
实施例4lt008对核辐射损伤保护的机制研究
核辐射对机体致死性损伤的主要原因是骨髓抑制、免疫系统抑制、胃肠道损伤等，这些损伤都会导致机体的炎症反应，因此炎症损伤是核辐射的重要环节。机体在感受到急性损伤信号或者状态失稳时会启动炎症反应机制[4-6]，炎症小体是一蛋白质复合物，它们能够识别各种不同的炎症刺激信号，其中包括damp信号，并通过多个信号通路诱导免疫和炎症相关基因表达，从而使机体能抵御应激造成的损伤[7-8]。而nlrp3炎症小体活化后产生的il-1β和il-18在机体的适应性免疫中起着重要作用，前面的细胞学实验表明lt008对辐射导致的细胞内ros的产生、细胞焦亡等均有影响，而细胞内ros和细胞焦亡都和nlrp3炎症小体相关，因此接下来我们研究lt008对nlrp3炎症小体有何影响。
4.1ltα-5能在体外和体内激活nlrp3炎症小体，并且对辐射后的细胞有保护作用。
4.1.1lt008能促进nlrp3炎症小体相关基因的表达的影响
方法：不同浓度的lt008（0、0.1、1、10、50和100μg/ml）处理thp-1细胞，分别在不同的时间点（1、3、8和24小时），1000rpm离心5分钟收集细胞，rt-pcr检测nlrp3、asc、caspase-1、il-1β和il-18mrna的表达
研究结果：lt008能快速增加il-1βmrna的表达，0.1μg/ml的lt008处理细胞1小时，il-1βmrna的表达增加至对照细胞的27.1倍（p<0.01），并随着lt008浓度的增加而逐渐增加，50μg/ml浓度时达峰值，为对照的50.6倍（p<0.01）随着作用时间的延长，il-1βmrna的表达逐渐下降，不同浓度的lt008处理细胞3小时时，il-1βmrna为对照的3倍左右，并维持至24小时仍没有明显降低。lt008也能增加nlrp3和caspase-1的mrna表达，给药后8小时开始升高，24小时时仍没有降至正常水平。而il-18在给药后24小时，并且lt008大于（包含）10μg/ml的浓度水平才检测到升高，而asc在所有浓度下的不同时间点均未检测到mrna表达的升高（图17）。
4.1.2lt008能够促进thp-1细胞分泌il-1β
方法：不同浓度的lt008（0、1μg/ml、100μg/ml和1mg/ml）处理thp-1细胞，24小时后1000rpm离心细胞5分钟取上清，elisa法检测上清中il-1β的含量。
试验结果：结果如图18所示，与对照组相比，1μg/ml的lt008处理细胞24小时就能增加il-1β的分泌，为对照的3.26倍（p<0.05），100μg/ml和1mg/ml的lt008处理细胞24小时能明显增加thp-1细胞分泌il-1β，分别为对照的25.6倍（p<0.01）和29.8倍（p<0.01）。以上结果表明lt008不但能够上调il-1β的表达，还能够增加thp-1细胞il-1β的分泌。说明lt008激活了nlrp3炎症小体。
4.1.3电镜结果显示lt008能够激活nlrp3炎症小体，并对核辐射作用下thp-1细胞有保护作用
方法：将细胞分为四组，lt组（图19b）lt00810μg/mllt008处理细胞8小时，对照组（图19a）用等量pbs处理细胞8小时，核辐射组（图19c）10gy60co-γ辐射即刻，lt和核辐射联合组（图19d）10μg/mllt008处理细胞8小时后行10gy60co-γ辐射即刻。1000rpm离心5分钟收集细胞，pbs洗细胞两次，4℃戊二醛固定细胞3天后电镜下观察。
试验结果：如图19所示，与对照组相比，lt008能够迅速激活细胞内的nlrp3炎症小体，电镜下可见黑色致密圆点（图19b）细胞基质基本正常，核辐射也可以激活炎症小体，但辐射后即刻收集的细胞，就可见细胞内有较多碎片，并且有大小不等的空泡（图19c）。lt008作用后的细胞再经历核辐射，可见细胞内空泡明显减少（图19d），细胞的状态好于单纯辐射细胞组。
以上结果表明，lt008能激活thp-1细胞中nlrp3炎症小体，且对核辐射导致的该细胞损伤有明显的保护作用。
4.1.4lt008能够激活促进野生小鼠脾脏il-1β表达升高，而且该升高和nlrp3炎症小体相关
方法：由于在细胞学水平lt008能够激活nlrp3炎症小体，因此我们进一步研究lt008能否在体内激活nlrp3炎症小体。由于前期的病理检查发现脾脏有明显的髓外造血，因此我们进一步研究lt008对脾脏的作用。我们取野生型的c57bl/6小鼠，尾静脉分别注射lt008（25μg/ml，10ml/kg）和等量pbs，三天后处死小鼠并解剖取脾脏，经固定、脱水、石蜡包埋、切片后进行免疫荧光染色测定脾脏组织中的il-1β。
结果：如图20所示，lt008能显著增强小鼠脾脏il-1β的免疫荧光的增强。
方法：用9.0gy60co-γ的辐照剂量作用于野生型小鼠，lt008组（w4组）辐射前连续三天给予250μg/kg剂量尾静脉注射，pbs对照组（w3组）给予10ml/kg的容积静脉注射pbs。在不同的时间点脱颈椎处死小鼠后，取脾脏组织，提取蛋白，用western-blot检测il-1β和il-18的蛋白表达。nlrp3-/-组小鼠经过同样的处理后检测。
结果：如图21所示，在野生型小鼠中，lt008能增加辐射小鼠脾脏中il-1β和il-18的蛋白表达，lt008组小鼠在辐射1天和3天后il-1β和il-18分别开始升高，3~5天为高峰，7天仍然明显高于对照，而在nlrp3-/-小鼠脾脏中il-1β和il-18表达水平均很低。
以上结果进一步证实lt008在体内和体外都能激活nlrp3炎症小体，并且lt008对辐射后的细胞有显著的保护作用，该保护作用有可能和lt008激活nlrp3炎症小体有关。
4.1.5进一步利用nlrp3炎症小体（nlrp3、asc、caspase-1）相关的三种基因敲除小鼠来验证lt008对核辐射的保护作用和nlrp3炎症小体相关
方法：具体见实例1的方法。我们进一步选用了nlrp3炎症小体复合体中三种成分nlrp3、asc和caspase-1基因敲除的小鼠（nlrp3-/-、asc-/-、caspase-1-/-）研究lt008对核辐射导致的小鼠骨髓损伤的保护作用是否通过炎症小体。三种基因敲除小鼠均根据体重随机分组，每种基因敲除小鼠分为四组，9.5gy致死剂量下，进行小鼠生存率和体重的监测研究，分为9.5gy模型组（组1）和9.5gylt008250µg/kg组（组2）；在9.0gy辐射剂量下，监测小鼠的血象、骨髓涂片和主要脏器的组织病理学检查，分别为：9.0gy模型组（组3）、9.0gylt008250µg/kg组（组4）。在辐射前两天和辐射当天，组1和组3小鼠尾静脉注射给予10ml/kg的pbs，组2和组4给予250µg/kg的lt008。
结果：
nlrp3-/-小鼠骨髓细胞学动态检测结果表明：辐射后d1，n3组的骨髓损伤程度较n4组轻，d3时骨髓损伤程度两组接近，d7开始，n4组骨髓损伤开始稍有好转，骨髓有核细胞增生较活跃，但是n3组骨髓有核细胞增生仍旧低下，直至d14。而直至d21开始，存活n4组小鼠的骨髓有核细胞才显示出增生活跃。而n3组因动物均死亡，未采集到d21天的骨髓，n4组小鼠未采集到d28天骨髓。以上结果提示，lt008对辐照所致nlrp3-/-小鼠骨髓损伤具有一定的保护作用。nlrp3-/-小鼠骨髓切片的病理结果显示：在辐射的作用下，n4组和n3组小鼠的骨髓切片显示从d1开始，骨髓的增生开始降低，至d3明显降低，该情况持续至d5。在lt008作用下，nlrp3-/-小鼠的骨髓切片显示在d7开始，骨髓增生开始恢复，d14天部分恢复正常的骨髓相，而至d21，骨髓相已经完全恢复正常。然而n3组小鼠骨髓增生显著降低一直持续至d14。由于n3组动物在d14后全部死亡，故未采集到d21的骨髓结果，而n4组则在d21解剖后，动物完全死亡，故未曾采集到28天的骨髓结果。以上结果显示，在lt008的作用下，nlrp3-/-小鼠的骨髓造血功能恢复较n3组有明显的增强。
asc-/-小鼠骨髓细胞学动态检测结果表明：a4组辐射后当天，a3组的骨髓损伤程度较lt008组轻，d5时骨髓损伤程度两组接近，d7开始，a4组骨髓损伤较对照组稍有的好转，从d10开始，a4组小鼠的骨髓有核细胞增生活跃，但是a3组骨髓有核细胞增生仍旧低下持续至d21，且后期由于a3组动物全部死亡，故未能进行后续a3组的骨髓检查。直至d21开始，a4组的骨髓各系的细胞形态、比例以及染色呈现基本正常，以上结果提示，lt008对辐照所致asc-/-小鼠骨髓损伤具有一定的保护作用。asc-/-小鼠骨髓切片的病理结果显示：在辐射的作用下，a4组和a3组小鼠的骨髓切片显示从d1开始，骨髓的增生开始降低，至d5增生极度降低，该情况持续至d7。在lt008作用下，asc-/-小鼠的骨髓切片显示在d7开始，骨髓增生降低程度开始恢复，d14部分恢复正常的骨髓相，而至d21，骨髓增生活跃，至d28天骨髓增生恢复正常。然而a3组的asc-/-小鼠骨髓增生极度降低一直持续至d14，至d21增生降低情况略有好转，后续由于a3组的小鼠全部死亡，未有d28的骨髓结果。以上结果显示，在lt008的作用下，a4组小鼠的骨髓造血功能恢复较a3组有明显的增强。
caspase-1-/-小鼠骨髓细胞学动态检测结果表明：c4组辐射后当天与c3组的骨髓损伤程度相似，直至d10天，c4组和c3组小鼠的骨髓细胞增生都仍旧欠活跃，至d14，c4组小鼠的骨髓有核细胞增生开始活跃，直至d28才完全恢复正常。但是c3组由于动物全部死亡，从d14起故未能进行后续对照组的骨髓检查。以上结果提示，lt008对辐照所致caspase-1-/-小鼠骨髓损伤具有较明显的保护作用。
caspaase-1-/-小鼠骨髓切片的病理结果显示：在辐射的作用下，c4组和c3组小鼠的骨髓切片显示从d1开始，骨髓的增生开始降低，至d5极度降低，该情况持续至d5。在lt008作用下，caspaase-1-/-小鼠的骨髓切片显示在d7开始，骨髓增生降低程度开始恢复，d10天开始骨髓增生活跃，d14天1/3骨髓腔开始出现增生的造血细胞，d21开始恢复正常的骨髓相，而至d28天，骨髓相已经完全恢复正常。然而c3组的caspaase-1-/-小鼠骨髓增生极度降低一直持续至d14。由于c3组动物在d14后全部死亡，故未采集到d21的骨髓结果。以上结果显示，在lt008的作用下，c4小鼠的骨髓造血功能恢复较c3组有明显的增强。对于d10两只濒死动物的骨髓切片结果显示骨髓增生极度降低，特别是c3组的动物骨髓显示出明显的出血征象，因此我们可以推测动物的死亡和骨髓的损伤密切相关。
以上三种基因敲除小鼠的骨髓结果显示：lt008对辐射后的基因敲除小鼠的骨髓恢复有一定的促进作用，但是从小鼠骨髓相的恢复时间看，基本在辐射后d14天左右才开始有恢复的趋势，低于野生型lt008组的辐射后d7天骨髓细胞学检查就显示出增生活跃。因此，nlrp3、asc、caspase-1炎症小体相关因子被敲除以后，骨髓恢复的时间延迟。
4.1.6lt008能在体内能同时激活nf-κb和nlrp3炎症小体
前期研究表明ltα与tnfr1和tnfr2结合后能诱导正常细胞线粒体产生锰超氧化物歧化酶对抗放化疗引起的氧化应激，保护骨髓细胞免受放化疗的损伤，同时增加肿瘤细胞对放化疗的敏感性。ltα对肿瘤细胞和骨髓来源细胞的不同反应是由于上皮来源肿瘤和骨髓来源细胞中nf-κb表达水平的差异。ltα激活tnfr1信号后又可通过进一步激活nf-κb分子而起到抗凋亡的作用，从而增强了骨髓来源细胞对抗化疗药物毒性的能力。
方法：我们取野生型的c57bl/6小鼠，尾静脉分别注射lt008（25μg/ml，10ml/kg）和等量pbs，三天后处死小鼠并解剖取胸骨，经固定、脱水、石蜡包埋、切片后进行免疫荧光染色nf-κb的p52亚基（红色）和nlrp3（绿色）。
结果：nf-κb的p52亚基，未激活时在细胞浆表达，激活后转位入核，结果如图24所示。对照组nf-κb（p52）红色荧光主要表达在胞浆，lt008处理组可见红色荧光转位入核，表明lt008在小鼠体内激活了nf-κb。同时与对照相比，lt008处理组的nlrp3炎症小体的表达明显增高（绿色荧光增强）。
3.1.7lt008在核辐射小鼠脾脏中通过上调bcl-xl抑制细胞凋亡，促进血小板的生成，从而促进机体对辐射导致的损伤的恢复
bcl-xl是bcl-2凋亡相关蛋白家族中的一种抗凋亡蛋白，多项研究表明，bcl-xl在血小板的生成和破坏中都发挥作用，bcl-xl在巨核细胞的分化、成熟及血小板产生过程都发挥作用。bcl-xl可能在造血干细胞向巨核细胞分化过程中，尤其在维持未成熟巨核细胞发育过程中具有重要作用；而在达到成熟的巨核细胞中表达明显降低，则可能与巨核细胞成熟后发生特殊的凋亡以至血小板形成有关，我们进一步观察了核辐射和/或lt008处理后野生型小鼠和nlrp3-/-小鼠脾脏中bcl-xl的表达。
方法：研究方法见效果实例1里的研究方法，在不同的时间点取小鼠的脾脏进行western-blot进行检测。
研究结果：lt008能在第七天开始明显增加核辐射小鼠脾脏中bcl-xl的表达，维持至18天，在nlrp3-/-小鼠中bcl-xl的表达也有升高，但是没有野生型小鼠明显，该结果也和血象监测中的血小板监测结果一致（见图25）。
5结论
从实施例1～4的试验结果可见：（1）lt008对核辐射导致的小鼠损伤有保护作用：lt008能使小鼠的生存率显著增加；能够促进血象的回升；促进骨髓造血功能的恢复；增加脾脏的髓外造血；
（2）lt008能保护核辐射导致的thp-1细胞的损伤：lt008能减少核辐射诱导的细胞凋亡和细胞焦亡；减少核辐射导致的ros的产生；逆转核辐射导致的细胞周期的阻滞，促进细胞增殖；
（3）lt008在thp-1细胞和小鼠体内均能激活nlrp3炎症小体，lt008在小鼠骨髓还能促进p52核转位，激活nf-κb；
（4）lt008对三种基因的敲除小鼠（nlrp3-/-、asc-/-和caspase-1-/-）核辐射后导致的损伤保护作用下降,表明lt008对核辐射导致的小鼠损伤的保护作用与nlrp3炎症小体有关；
（5）lt008能在小鼠脾脏中促进凋亡抑制因子bcl-xl的表达，该作用可能与血小板的再生，进而机体重新启动免疫有关；
因此，lt008在防治核辐射性疾病，特别是辐射所致的急性、慢性组织损伤甚至严重的器官功能障碍疾病方面具有良好的效果，可制备成应用于此方面的新药。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110>苏州华测生物技术有限公司
<120>淋巴毒素衍生物的新用途
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