一种高效提取酥瓜基因组dna的方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及生物技术领域，具体设及一种使用改良的CTAB法提取酥瓜基因组DNA 的方法。
【背景技术】
[0002] 总DNA的提取是分子生物学的基本内容之一，高质量的DNA是进行基因克隆、基因 表达、基因功能分析等研究的必要前提。酥瓜，属于甜瓜中的一种，为安徽省淮南市潘集区 的特产，该作物性情溫润、喜光，适宜生长溫度15-35度，最佳生长溫度25-30度，忌连作。因 果实酥脆而得名，味甜、皮薄品质好，富含多种维生素。潘集酥瓜是特色农产品，全区酥瓜种 植面积2012年已达10000亩，建立了无公害标准化生产基地，还制定出台了淮南市无公害酥 瓜栽培技术规程，酥瓜种植已成为潘集区农业产业结构调整的新亮点。潘集酥瓜在为市民 带来口福的同时，也成为当地农民增收的重要途径。酥瓜体内含有大量的单宁、多糖、酸类 等物质，运增加了从酥瓜组织中提取总DNA的难度。
[0003] 虽然目前商品化DNA提取试剂盒较多，具有操作简便、用时短等优点，但提取的基 因组DNA产率低、纯度不高。
【发明内容】
[0004] 本发明旨在提供一种从酥瓜中提取基因组DNA的方法，W解决现有技术中从酥瓜 中提取的DNA产率低、纯度不高的技术问题。
[0005] 为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种使用改良的CTAB法高效 的从酥瓜中提取基因组DNA的方法。该方法包括W下步骤：
[0006] 1)取材料，用液氮研磨成粉末，直接向研鉢内加入2%CTAB提取液，解冻后转移至 离屯、管，摇匀后水浴，冷却；
[0007] 2)加入氯仿/异戊醇，摇匀后离屯、；
[000引3)取上清液加入到已预冷的装有乙醇的离屯、管中，先放入-80°C环境中静置，再放 入-20°C环境中静置；
[0009] 4)倒出乙醇，先用75%乙醇冲洗，再用无水乙醇冲洗，离屯、后吸出残余乙醇，自然 干燥后溶解DNA;
[0010] 5)加入核糖核酸酶，在一定条件下将RNA充分消化，加入氯仿/异戊醇，混匀后离 屯、；
[0011] 6)取上清液，加入到含有无水乙醇和醋酸钢的离屯、管中，-80°C静置沉淀；
[0012] 7)倒出乙醇，先用75 %乙醇冲洗，再用无水乙醇冲洗，干燥后溶解DNA，低溫保存。
[0013] 本发明一个优选的方面，步骤1)可优化为:取0.2mg酥瓜新鲜嫩叶，用液氮研磨充 分后，向研鉢中加入50化1 2 % CTAB提取液，解冻后呈糊状，倒入离屯、管，再用10化1 CTAB冲 洗研鉢。轻轻摇晃均匀，置65°C水浴30min，期间每隔5min轻轻倒转离屯、管数次，后拿出冷却 至室溫。
[0014] 上述步骤2)可优化为：加入60化1体积比为24:1的氯仿/异戊醇，轻缓摇至均匀，4 °C、12000巧m 离屯、1 Omin。
[0015] 上述步骤3)可优化为：小屯、吸取上清液到已加入80化1-20°C的预冷无水乙醇的 2ml离屯、管中，放入-80°C环境中充分静置化，后转入-20°C环境中静置化，充分出现白色沉 淀。
[0016] 上述步骤4)可优化为:小屯、倒出无水乙醇后，加入75%乙醇冲洗两次，再用无水乙 醇冲洗一次，瞬时离屯、后倒出残余乙醇，自然干燥数分钟，加入50化1无菌水或0.1 X TE缓冲 液溶解DNA。
[0017] 上述步骤5)可优化为:加入扣1 lOng/ml的核糖核酸酶，37°C烘箱中保溫化后冷却 至室溫，使核糖核酸充分降解，加入500μ1氯仿/异戊醇，轻缓倒转数分钟混匀后，4°C， 12000巧m 离屯、1 Omin。
[0018] 上述步骤6)可优化为:小屯、吸取上清液，加入到含有2倍体积的无水乙醇和十分之 一体积的3m〇Vl的醋酸钢的离屯、管中，-80°C静置沉淀。
[0019] 上述步骤7)可优化为：小屯、倒去无水乙醇，用70%乙醇冲洗两次后再用无水乙醇 冲洗一次，倒置自然干燥后加入1〇化1无菌水或TE缓冲液溶解DNA，-20°c保存备用。
[0020] 本发明的另一个优选方面，上述方法还包括如下步骤:取化1步骤7)中获得的DNA 溶液，用0.8 %琼脂糖凝胶和核酸定量仪分别检测DNA纯度和浓度。
[0021] 本发明的有益效果为:在本发明中使用改良的CTAB法的提取过程中，是将提取液 加入研鉢内，使其与材料充分融合，提取更高效;DNA沉淀是置于-80°C环境下，沉淀更充分 更快速;DNA沉淀用75%乙醇清洗后再用无水乙醇清洗，离屯、后吸出残留乙醇，加快DNA沉淀 干燥，缩短时间。
[0022] 本发明使用改良的CTAB法提取酥瓜中的基因组DNA，克服了原CTAB法存在操作繁 琐、耗时长、有毒化学药品使用较多等缺点，并且改良后的CTAB法提取含有多糖多酪的酥 瓜，可有效避免提取的DNA被污染。
【附图说明】
[0023] 图1是4种方法提取的DNA凝胶电泳图。
【具体实施方式】
[0024] 下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细的说明，但不应理解为对本发明的 限制。在不背离本发明精神和实质的前提下，对本发明所作的修饰或者替换，均属于本发明 的范畴：
[0025] 实施例1
[00%]取4份0.2g酥瓜幼嫩叶片，分别使用改良CTAB法、原CTAB法、SDS法、试剂盒Γ天根" 植物基因组DNA提取试剂盒DP305-02)四种方法提取DNA，每种方法Ξ次重复。
[0027] 使用改良CTAB法提取酥瓜基因组DNA的具体操作步骤为：
[0028] 1)取0.2mg酥瓜新鲜嫩叶，用液氮研磨充分后，向研鉢中加入50化1 2 % CTAB提取 液，解冻后呈糊状，倒入离屯、管，再用100μΙ CTAB冲洗研鉢。轻轻摇晃均匀，置65°C水浴 30min(期间每隔5min轻轻倒转离屯、管数次)后拿出，冷却至室溫。
[00巧]2)加入600μ1氯仿:异戊醇（24:1)，轻缓摇至均匀，4°C、12000巧m离屯、lOmin。
[0030] 3)小屯、吸取上清液到已加入80化1预冷无水乙醇(-20°C)的2ml离屯、管中，放入-80 °C环境中充分静置化，后转入-20°C环境中静置化，充分出现白色沉淀。
[0031] 4)小屯、倒出无水乙醇后，加入75%乙醇冲洗两次，再用无水乙醇冲洗一次，瞬时离 屯、后吸出残余乙醇，自然干燥数分钟，加入50化1无菌水或0.1 X TE缓冲液溶解DNA。
[0032] 5)加入扣1 lOng/ml的RNase，37°C烘箱中保溫化后冷却至室溫。加入50化1氯仿/ 异戊醇，轻缓倒转数分钟混匀后，4°C，12000巧m离屯、lOmin。
[0033] 6)小屯、吸取上清液，加入到含有2倍体积的无水乙醇和十分之一体积的3mol/l的 醋酸钢的离屯、管中，-80°C静置沉淀。
[0034] 7)小屯、倒去无水乙醇，用70%乙醇冲洗两次后再用无水乙醇冲洗一次，倒置自然 干燥后加入10化1无菌水或TE缓冲液溶解DNA，-20°C保存备用。
[0035] 8)取化1 DNA溶液，0.8%琼脂糖凝胶和核酸定量仪检测DNA浓度和纯度。
[0036] 原CTAB法W及SDS法的具体操作步骤参见一般教科书、SDS法;试剂盒法提取酥瓜 的DNA具体操作参见试剂盒的说明书。
[0037] 使用核酸定量仪检测上述4种提取方法提取的DNA浓度结果见表1:
[0038] 表1四种方法提取的DNA浓度
[0039]
[0040] 从表1中可见，使用本发明提供的改良的CTAB法提取酥瓜的DNA的浓度要显著高于 其他Ξ种方法，差异达到极显著，且无蛋白W及RNA的污染。
[0041] 使用琼脂糖凝胶电泳检测上述4种提取方法提取的DNA的纯度结果见图1，图1的结 果表明，改良的CTAB法较其他Ξ种方法提取的酥瓜叶片基因组DNA产率和纯度远远高于其 他Ξ种方法、并且无降解。
【主权项】
1. 一种高效提取酥瓜基因组DNA的方法，其特征在于，使用改良的CTAB法。2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述改良的CTAB法包括如下步骤： 1) 取材料，用液氮研磨成粉末，直接向研钵内加入2 % CTAB提取液，解冻后转移至离心 管，摇匀后水浴，冷却； 2) 加入氯仿/异戊醇，摇匀后离心； 3) 取上清液加入到已预冷的装有乙醇的离心管中，先放入_80°C环境中静置，再放入-20°C环境中静置； 4) 倒出乙醇，先用7 5 %乙醇冲洗，再用无水乙醇冲洗，离心后吸出残余乙醇，自然干燥 后溶解DNA; 5) 加入核糖核酸酶，在一定条件下将RNA充分消化，加入氯仿/异戊醇，混匀后离心； 6) 取上清液，加入到含有无水乙醇和醋酸钠的离心管中，_80°C静置沉淀； 7) 倒出乙醇，先用75 %乙醇冲洗，再用无水乙醇冲洗，干燥后溶解DNA，低温保存。3. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤1)可为:取0.2mg酥瓜新鲜嫩叶，用液 氮研磨充分后，向研钵中加入500μ1 2 % CTAB提取液，解冻后呈糊状，倒入离心管，再用100μ 1 CTAB冲洗研钵。轻轻摇晃均匀，置于65°C水浴30min，期间每隔5min轻轻倒转离心管数次， 后拿出冷却至室温。4. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤2)可为:加入600μ1体积比为24:1的氯 仿/异戊醇，轻缓摇至均匀，4°C、12000rpm离心10min。5. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤3)可为：小心吸取上清液到已加入800 yl-20°C的预冷无水乙醇的2ml离心管中，放入-80°C环境中充分静置3h，后转入-20°C环境 中静置lh，充分出现白色沉淀。6. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤4)可为：小心倒出无水乙醇后，加入 75%乙醇冲洗两次，再用无水乙醇冲洗一次，瞬时离心后吸出残余乙醇，自然干燥数分钟， 加入500μ1无菌水或0.1 X TE缓冲液溶解DNA。7. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤5)可为：加入5μ110ng/ml的核糖核酸 酶，37°C烘箱中保温lh后冷却至室温，使核糖核酸充分降解，加入500μ1氯仿/异戊醇，轻缓 倒转数分钟混匀后，4°C，12000rpm离心10min。8. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤6)可为:小心吸取上清液，加入到含有 2倍体积的无水乙醇和十分之一体积的3mol/l的醋酸钠的离心管中，-80°C静置沉淀。9. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤7)可为：小心倒去无水乙醇，用70%乙 醇冲洗两次后再用无水乙醇冲洗一次，倒置自然干燥后加入?〇〇μ1无菌水或TE缓冲液溶解 DNA，-20°C保存备用。10. 根据权利要求2~9任一项所述的方法，其特征在于，上述方法还包括如下步骤:取1 μL步骤7)中获得的DNA溶液，用0.8%琼脂糖凝胶和核酸定量仪分别检测DNA纯度和浓度。
【专利摘要】本发明涉及一种高效提取酥瓜基因组DNA的方法。该方法包括如下步骤：取材料，用液氮研磨成粉末，直接向研钵内加入2％CTAB提取液，解冻后转移至离心管，摇匀后水浴，冷却；加入氯仿和异戊醇，摇匀后离心；取上清液加入到已预冷的装有乙醇的离心管中，先放入-80℃环境中静置，再放入-20℃环境中静置；倒出乙醇，先用75％乙醇冲洗，再用无水乙醇冲洗，离心后吸出残余乙醇，自然干燥后溶解DNA；加入核糖核酸酶，将RNA充分消化，加入氯仿/异戊醇，混匀后离心；取上清液，加入到含有无水乙醇和醋酸钠的离心管中，-80℃静置沉淀；倒出乙醇，先用75％乙醇冲洗，再用无水乙醇冲洗，干燥后溶解DNA，低温保存。
【IPC分类】C12N15/10
【公开号】CN105505919
【申请号】CN201610052253
【发明人】汪承刚, 葛继涛, 陈国户, 袁凌云, 朱世东, 刘姗, 方柔, 刘思嘉, 张盛云
【申请人】安徽农业大学
【公开日】2016年4月20日
【申请日】2016年1月25日